一种面部皮肤抗衰老营养液冻干粉及其产品和应用方法技术

本发明专利技术提供一种面部皮肤抗衰老营养液冻干粉的制备方法及其产品和应用方法，所述抗衰老营养液冻干粉是将自体脂肪来源的间充质干细胞因子提取液与营养成分复配后冻干制得的，所述干细胞因子提取液是将培养获得的自体脂肪间充质干细胞进行细胞裂解，离心收集上清液所得，包含多种细胞因子，可发挥抗衰老及美容护肤效果。本发明专利技术使用无动物源血清培养基对自体脂肪间充质干细胞扩增培养后收集细胞裂解物质，在保证了有效性的前提下，提升了产品的安全性。安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种面部皮肤抗衰老营养液冻干粉及其产品和应用方法


[0001]本专利技术涉及美容医学
，具体涉及一种面部皮肤抗衰老营养液冻干粉的制备方法及其产品和应用方法。

技术介绍

[0002]皮肤位于机体的最外层，直接与外界环境接触，能够防止微生物入侵、化学成分危害、紫外线损伤等外部刺激，是机体的第一道防线。由于年龄自然增长，日常护理不到位、化妆品使用不恰当或者过度使用，过渡疲劳和各种意外等因素，很多人出现了皮肤早衰的现象。尤其是面部肌肤，症状包括皮肤干燥粗糙，松弛，皱纹、斑点增加，角质 层变薄，易过敏等，然而目前市面少见有效的抗皮肤衰老产品。
[0003]干细胞是一类具有自我更新和增殖分化能力的多潜能细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞在临床上具有广泛的应用前景，特别是自体脂肪来源的间充质干细胞。干细胞在生长、增殖、分化过程中，细胞内会分泌大量的细胞因子，其中包含多种生长因子，例如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、角质细胞生长因子(KGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子
‑
β(TGF
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β)以及一些相关的胶原蛋白等活性物质，而这些因子都会参与不同组织及反应的机制中。
[0004]细胞因子具有多种功能，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥重要作用。细胞因子能促进皮肤组织的生长繁殖；能促进与皮肤损伤有关细胞的快速生长繁殖，并调节细胞间基质的合成、分泌及分解；能促进角质层细胞的再生，加速皮肤角质层和基质层的修复，促进人体皮肤细胞的生长；能增强皮肤细胞的蛋白质的合成和细胞代谢，具有延缓皮肤细胞衰老、促进表皮细胞的修复和生长作用，使皮肤光滑丰润。
[0005]间充质干细胞的来源广泛，易于分离培养，作为干细胞抗衰老产品的种子细胞极具优势。然而，传统的间充质干细胞培养方法使用的培养基大多含有动物血清，使用时存在不安全因素。此外，目前细胞因子大多来自干细胞培养液，而包含细胞因子等其它活性成分在内的细胞内容物未能有效释放到培养液中。目前，以细胞因子为主要活性成分的抗衰老产品大多以液态或乳液形式存在，不利于存储，亟需开发适于长期保存的新剂型。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于提供一种面部皮肤抗衰老营养液冻干粉的制备方法。
[0007]本专利技术的再一目的在于：提供一种上述方法制备的面部皮肤抗衰老营养液冻干粉产品。
[0008]本专利技术的又一目的在于：提供一种上述产品的应用方法。
[0009]本专利技术目的通过下述方案实现：一种抗衰老营养液冻干粉的制备方法，抗衰老营养液冻干粉是将自体脂肪来源的间充质干细胞因子提取液与营养成分复配后冻干制得的，包括：（1）脂肪来源的间充质干细胞进行体外培养；
（2）收集培养得到的脂肪间充质干细胞，进行细胞裂解，得到细胞裂解液；细胞裂解液经离心得到上清液，作为干细胞因子提取液；（3）将干细胞因子提取液与营养液按2
‑
3:2
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3的体积比混合，得原液；（4）将原液与冻干保护剂按0.8
‑
1.2: 8.5
‑
9.5的体积比混合，冷冻干燥；（5）所述的营养成分为：维生素C10
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50ug/ml、透明质酸钠1
‑
5mg/ml和人转铁蛋白1
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10ug/ml； 所述冻干保护剂为：甘露醇50
‑
150g/L、海藻糖1
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10g/L和右旋糖酐40 5
‑
15g/L。
[0010]进一步的，步骤（1）中，脂肪来源的间充质干细胞进行体外培养使用的细胞培养基为：含有重组人胰岛素1
‑
100ug/ml、人转铁蛋白1
‑
50ug/ml和亚硒酸1
‑
80ug/ml的DMEM培养基；培养条件为：36.5～37.5℃，5％CO2；脂肪间充质干细胞采用贴壁培养，待细胞长满至85％～90％，消化并收集细胞；脂肪间充质干细胞选用P3～P20代中的至少一种。
[0011]优选地，步骤（1）中，所用细胞培养基为：DMEM+重组人胰岛素5ug/ml+人转铁蛋白5ug/ml+亚硒酸7ug/ml，培养条件为：37.0℃。
[0012]自体脂肪间充质干细胞采用贴壁培养，待细胞长满至90％左右，消化并收集细胞。
[0013]自体脂肪间充质干细胞优选P8
‑
P12代中的至少一种。
[0014]步骤（2）中，细胞裂解方法是：向1000万IU收集培养得到的脂肪间充质干细胞中加入0.1
‑
1mL生理盐水重悬，置于离心管内，再放入
‑
60℃～
‑
80 ℃冰箱中反复冻融，然后超声破碎细胞，得到的细胞裂解液经筛网过滤，所得滤液于4℃， 10000rpm离心15min，收集上清液，作为干细胞因子提取液。
[0015]优选的，步骤（2）中，超声破碎细胞的超声功率为400
‑
650W，频率为20
‑
25KHz，每次超声5
‑
10s，共超声5次；和/或细胞裂解液经筛网孔径为20
‑
40um筛网过滤。
[0016]优选的，步骤（2）中，包括收集培养得到的自体脂肪间充质干细胞，向1000万IU细胞中加入0.5
‑
1mL 生理盐水重悬，置于离心管内。再放入
‑
80℃冰箱中反复冻融(冻1小时后，置于37℃恒温水浴锅解冻，重复3次)，然后，超声破碎细胞，得到的细胞裂解液经筛网孔径20
‑
40um筛网过滤，所得滤液于保存于4℃，10000rpm离心15min，收集上清液。
[0017]步骤（4）中，冷冻干燥的温度为
‑
60℃～
‑
80℃，冻干机预冻4h
‑
8h，然后真空冷冻48h
‑
72h。
[0018]进一步的，还包括对培养得到的脂肪间充质干细胞进行干细胞标志物鉴定；和/或，还包括对干细胞因子提取液中的细胞因子进行检测(质控)。
[0019]优选地，采用流式细胞术对培养得到的自体脂肪间充质干细胞进行干细胞标志物鉴定，所述干细胞标志物包括阳性标志物：CD105、CD73和CD90以及阴性标志物CD45、CD34和CD14等。
[0020]本专利技术还提供了一种抗衰老营养液冻干粉，根据上述任一项所述方法制备得到的。
[0021]本专利技术也提供了一种抗衰老营养液冻干粉的用法，抗衰老营养液冻干粉溶于0.9%生理盐水，制备得到抗衰老营养液，可以通过纳米晶或纳米针导入肌肤。
[0022]使用时，用0.9％生理盐水将所述抗衰老组合物冻干粉溶解，均匀滴在皮肤上，使用纳米晶或纳米针进行导入操作，多余的残留液可继续按摩至完全吸收。
[0023]借由上述技术方案，本专利技术至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗衰老营养液冻干粉的制备方法，其特征在于，抗衰老营养液冻干粉是将自体脂肪来源的间充质干细胞因子提取液与营养成分复配后冻干制得的，包括：（1）脂肪来源的间充质干细胞进行体外培养；（2）收集培养得到的脂肪间充质干细胞，进行细胞裂解，得到细胞裂解液；细胞裂解液经离心得到上清液，作为干细胞因子提取液；（3）将干细胞因子提取液与营养液按2
‑
3:2
‑
3的体积比混合，得原液；（4）将原液与冻干保护剂按0.8
‑
1.2: 8.5
‑
9.5的体积比混合，冷冻干燥；（5）所述营养成分为：维生素C10
‑
50ug/ml、透明质酸钠1
‑
5mg/ml和人转铁蛋白1
‑
10ug/ml； 所述冻干保护剂为：甘露醇50
‑
150g/L、海藻糖1
‑
10g/L和右旋糖酐40 5
‑
15g/L。2.根据权利要求1所述的抗衰老营养液冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，脂肪来源的间充质干细胞进行体外培养使用的细胞培养基为：含有重组人胰岛素1
‑
100ug/ml、人转铁蛋白1
‑
50ug/ml和亚硒酸1
‑
80ug/ml的DMEM培养基；培养条件为：36.5～37.5℃，5％CO2；脂肪间充质干细胞采用贴壁培养，待细胞长满至85％～90％，消化并收集细胞；脂肪间充质干细胞选用P3～P20代中的至少一种。3.根据权利要求1所述的抗衰老营养液冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，细胞裂解方法是：1000万IU收集培养得到的脂肪间充质干细胞中加入0.1
‑
1mL生理盐水重悬，置于离心管内，再放入
‑
60℃～
‑
80 ℃冰箱中反复冻融，然后超声破碎细胞，得到的细胞裂解液经筛网过滤得滤液，所得滤液于4℃，10000rpm离心15min，收集上清液，作为干细胞因子提取液。4.根据权利要求1所述的抗衰老营养液冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤（4）中；冷冻干燥的温度为
‑
60℃～
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80℃，冻干机预冻4h
‑
8h，然后真空冷冻48h
‑
72h。5.根据权利要求1至4任一项所述的抗衰老营养液冻干粉的制备方法，其特征在于，按下述步骤制备：（1）脂肪来源的间充质干细胞进行体外培养：将自体脂肪来源的间充质干细胞按照5000
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10000个/cm2的密度进行接种，进行常规的细胞培养，每次传代比例均为1:10；对自体脂肪间充质干细胞进行干细胞标志物鉴定；对自体脂肪间充质干细胞进行形态鉴定；（2）收集培养得到的脂肪间充质干细胞，向1000万IU细胞中加入0.5mL生理盐水重悬，放入1.5ml离心管内，再放入
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80℃冰箱中反复冻融3次，每次需置于37℃恒温水浴锅解冻，然后超声条件下处理细胞5次，每次超声时长5
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10s，超声功率600W，频率：20KHz，分多次进行超声裂解，得到细胞裂解液；采用孔径20um筛网过滤，收集液体；将收集的液体置于高速冷冻离心机内，4℃，10000rpm离心15min，收集上清液，得到干细胞因子提取液(液体A)，并保存于
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20℃环境中；对干细胞因子提取液的成分进行检测；（3）将干细胞因子提取液与营养液混合，向100ml生理盐水中加入4mg维生素C，3g透明质酸钠，0.8mg人转铁蛋白，得到液体B；将液体A和液体B混合得到冻干粉原液得原液；（4）将原液与冻干保护剂混合制备冻干粉：称取甘露醇70g，海藻糖4g，右旋糖酐40 5g，用500mL去离子水溶解至澄清，加入冻干粉原液，最终定容至1L，将上一步所得溶液在0 .22μm的滤器中过滤，收集于无菌容器；
将无菌液体进行无菌操作，分装至5ml西林瓶(装量3ml)内，半压塞，冷冻干燥；冻干机预冻4h，然后
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【专利技术属性】
技术研发人员：郭丽梅，
申请(专利权)人：上海锦晖医疗美容门诊部，
类型：发明
国别省市：