本发明专利技术公开了一种天目地黄的遗传转化方法，包括以下步骤：(1)、天目地黄PDS基因克隆；(2)CRISPR/Cas9基因编辑载体构建并载入根癌农杆菌；(3)天目地黄遗传转化；(4)、转基因植株的分子检测。本发明专利技术具有以下有益效果：1.天目地黄的叶片愈伤褐化率显著降低，再生芽分化率高，再生芽的生长状态较好；2.遗传转化效率的鉴定方法有改进；3.近缘物种地黄的分化培养基中生长素NAA的浓度为0.1～0.5mg/L，同样的NAA浓度用于天目地黄遗传转化，再生芽分化率很低，改进NAA的浓度为0.05mg/L时，天目地黄的再生分化率显著提高。生分化率显著提高。生分化率显著提高。
【技术实现步骤摘要】
一种天目地黄的遗传转化方法
[0001]本专利技术涉及植物生物
，具体涉及一种天目地黄的遗传转化方法。
技术介绍
[0002]天目地黄(Rehmannia chingii)性寒，味甘、苦，因其主要分布在浙江天目山一带，又称为浙地黄，是地黄属重要的野生种质资源之一。
[0003]据民间用药记载，天目地黄以全草和根入药，具有清热凉血、养阴生津和补益肝肾的功效。天目地黄富含环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、地黄苷、益母草苷及多糖类成分。已有研究表明，天目地黄的全草及根中均含有丰富的梓醇和毛蕊花糖苷，在抗菌、抗炎、降血糖及神经保护等多方面具有重要的药理活性。当前迅速发展的转录组学、代谢组学和功能基因组学为揭示天目地黄药效成分生物合成的分子机制、保障天目地黄药材的品质提供了契机。然而，目前天目地黄的遗传转化体系尚未见报道，建立高效的遗传转化体系对于研究天目地黄生长发育、逆境胁迫及次生代谢产物的合成机制意义重大。
[0004]八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的沉默或缺失会抑制类胡萝卜素的正常合成，从而影响类胡萝卜素对叶绿素的保护，造成富含叶绿素的绿色植物褪色而呈现白化现象。因此，利用CRISPR/Cas9系统敲除PDS基因能够非常直观的检验遗传转化体系及其转化效率。
[0005]本专利技术利用根癌农杆菌介导的叶盘法对CRISPR/Cas9基因编辑载体进行转化，首次实现了对天目地黄的遗传转化，并成功的对天目地黄PDS基因的基因组DNA靶序列进行定向修饰，对于天目地黄的功能基因组学研究奠定了基础。
[0006]天目地黄遗传转化的方法目前未见相关报道。虽然其近缘种地黄的遗传转化已经建立，然而，由于两个物种的遗传差异较大，利用地黄遗传转化的方法进行天目地黄的遗传转化效率很低。探索一种高效的根癌农杆菌介导的天目地黄遗传转化的方法成为急需解决的技术问题。
技术实现思路
[0007]专利技术目的：针对现有技术的不足，本专利技术提供一种天目地黄的遗传转化方法，实现了利用CRISPR/Cas9系统对天目地黄目标基因进行定向敲除。
[0008]本专利技术通过将携带有CRISPR/Cas9基因编辑载体的农杆菌与天目地黄外植体进行共培养，使得外源T
‑
DNA片段插入到外植体基因组，经过抗生素筛选后，获得抗性植株，通过目标基因靶位点序列分析获，即可获得靶基因突变的天目地黄再生植株，从而实现了本专利技术的目的。
[0009]技术方案：一种天目地黄的遗传转化方法，包括以下步骤：
[0010](1)、天目地黄PDS基因克隆
[0011]根据天目地黄的转录组注释结果，筛选与地黄RgPDS1基因同源性最高的一条转录本，设计特异的PCR引物，以天目地黄的cDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶扩增天目地黄PDS基因的全长编码序列，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0012](2)、CRISPR/Cas9基因编辑载体构建并载入根癌农杆菌
[0013]克隆步骤(1)得到的天目地黄PDS基因，在外显子上靠近ATG的一端选取一段能够被Cas9基因高效编辑的靶序列，采用混合酶切连接法将sgRNA靶序列插入到CRISPR/Cas9基因编辑载体中，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体中sgRNA由拟南芥U6启动子驱动，zCas9基因由花椰菜病毒的35S启动子驱动，获得天目地黄PDS基因的CRISPR/Cas9表达载体，然后将成功构建的CRISPR/Cas9表达载体转入根癌农杆菌得到含有基因编辑载体的根癌农杆菌；
[0014](3)、天目地黄遗传转化
[0015]以天目地黄叶片为外植体，将天目地黄无菌苗的叶片剪成0.5～1.0cm大小的叶盘，浸泡入活化的步骤(2)得到的含有基因编辑载体的根癌农杆菌的MS液体培养基中，5～10min后将外植体移至含有80～120μmol/L乙酰丁香酮的MS固体共培养培养基中，24～26℃下暗培养2～3d，然后用无菌水清洗外植体上的农杆菌，滤纸吸干外植体表面的无菌水后，转入含150～300mg/L特美汀、50
‑
100mg/L卡那霉素、0.05mg/L NAA和2.0mg/L 6
‑
BA的MS固体分化培养基中，25～27℃下光培养，待抗性芽长至2～3cm时，切取抗性芽转入MS生根培养基，光培养，诱导生根得到转基因植株，其中：
[0016]MS共培养培养基、分化培养及和生根培养基的pH值均为5.5～6.0；
[0017](4)、转基因植株的分子检测
[0018]利用CRISPR/Cas9表达载体的Cas9基因和载体序列设计2对特异引物对转基因植株进行PCR分子检测，进而判断检测抗性愈伤、抗性芽或抗性植株基因组中是否已经转入表达载体的T
‑
DNA序列，若是，则有2条目的条带，为阳性转基因植株；若否，则没有目的条带，为假阳性非转基因植株。
[0019]进一步地，还包括步骤(5)转基因植株靶位点DNA序列分析：
[0020]提取步骤(4)得到的阳性转基因植株的基因组DNA，在基因编辑的靶点序列前后设计特异引物进行PCR扩增，扩增产物胶回收并连接TA克隆载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行测序，或回收PCR扩增产物进行高通量二代扩增序列测序，确定靶点序列是否突变以及突变的类型，若已经突变，靶点序列存在核苷酸碱基缺失、插入或替换；若未突变，靶点序列核苷酸碱基没有变化。
[0021]进一步地，步骤(1)中所述地黄RgPDS1基因的NCBI登记号MW132596。
[0022]进一步地，步骤(1)中所述特异的PCR引物包括正向引物RcPDS1_F和反向引物RcPDS1_R，其中：
[0023]正向引物RcPDS1_F：5
’‑
CAGTTGCCTGAGCTGTTGAA
‑3’
；
[0024]反向引物RcPDS1_R：5
’‑
GCTTCCCTATCTTCTGTCTTCC
‑3’
。
[0025]进一步地，步骤(2)中所述CRISPR/Cas9基因编辑载体含有卡那霉素抗性基因。
[0026]进一步地，步骤(3)中所述光培养为每天光照培养14h，暗培养10h。
[0027]进一步地，步骤(4)中所述2对特异引物包括第一特异引物和第二特异引物；
[0028]第一特异引物正向引物Cas9_F：5
’‑
TCAACGGCATTCGGGACAAG
‑3’
；
[0029]第一特异引物反向引物Cas9_R：5
’‑
CCACATACATATCGCGGCCA
‑3’
；
[0030]第二特异引物正向引物pKSE401_F：5
’‑
TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC
‑3’
；
[0031]第二特异引物反向引物sgRcPDS1_R：5...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种天目地黄的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、天目地黄PDS基因克隆根据天目地黄的转录组注释结果，筛选与地黄RgPDS1基因同源性最高的一条转录本，设计特异的PCR引物，以天目地黄的cDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶扩增天目地黄PDS基因的全长编码序列，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)、CRISPR/Cas9基因编辑载体构建并载入根癌农杆菌克隆步骤(1)得到的天目地黄PDS基因，在外显子上靠近ATG的一端选取一段能够被Cas9基因高效编辑的靶序列，采用混合酶切连接法将sgRNA靶序列插入到CRISPR/Cas9基因编辑载体中，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体中sgRNA由拟南芥U6启动子驱动，zCas9基因由花椰菜病毒的35S启动子驱动，获得天目地黄PDS基因的CRISPR/Cas9表达载体，然后将成功构建的CRISPR/Cas9表达载体转入根癌农杆菌得到含有基因编辑载体的根癌农杆菌；(3)、天目地黄遗传转化以天目地黄叶片为外植体，将天目地黄无菌苗的叶片剪成0.5～1.0cm大小的叶盘，浸泡入活化的步骤(2)得到的含有基因编辑载体的根癌农杆菌的MS液体培养基中，5～10min后将外植体移至含有80～120μmol/L乙酰丁香酮的MS固体共培养培养基中，24～26℃下暗培养2～3d，然后用无菌水清洗外植体上的农杆菌，滤纸吸干外植体表面的无菌水后，转入含150～300mg/L特美汀、50
‑
100mg/L卡那霉素、0.05mg/L NAA和2.0mg/L 6
‑
BA的MS固体分化培养基中，25～27℃下光培养，待抗性芽长至2～3cm时，切取抗性芽转入MS生根培养基，光培养，诱导生根得到转基因植株，其中：MS共培养培养基、分化培养及和生根培养基的pH值均为5.5～6.0；(4)、转基因植株的分子检测利用CRISPR/Cas9表达载体的Cas9基因和载体序列设计2对特异引物对转基因植株进行PCR分子检测，进而判断检测抗性愈伤、抗性芽或抗性植株基因组中是否已经转入表达载体的T
‑
DNA序列，若是，则有2条目的条带，为阳性转基因植株；若否，则没有目的条带，为假阳性非转基因植株。2.如权利要求1所述的一种天目地黄的遗传转化方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王丰青，左鑫，魏荷，孙红正，张重义，李烜桢，郭林秀，
申请(专利权)人：河南省作物分子育种研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。