生物分子的标记制造技术

可逆地标记生物分子的方法包括提供接头分子(11)，其包含含有反应中心的第一官能团(LG)、包含反应中心的第二官能团(FG)和可切割部分(例如可水解部分)(A

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物分子的标记
[0001]本专利技术一般性地涉及生物分子的标记。更具体地，尽管并非排他性的，本专利技术涉及可逆地标记生物分子的方法。
[0002]生物缀合是其中在生物分子和第二分子之间形成共价键的化学策略。第二分子可以充当标签或标记物，在这种情况下，第二分子将赋予生物分子以新的特性。第二分子可赋予适合用于测量生物分子的位置和/或浓度的特性，例如，以跟踪细胞事件、确定酶功能、测量药物递送等。第二分子可以是例如荧光分子、放射性物质和/或适合用于检测测定的不同生物分子。或者，可以选择第二分子，以便其使生物分子在特定环境中更易溶解或更稳定。在其他情况下，第二分子可用于靶向另一个生物分子。
[0003]一些简单的缀合化学反应支配那些施加于生物分子的位点选择性化学修饰(或官能化)(例如，Hermanson,G.T.Bioconjugate Techniques,2013；Bioconjugated Oligonucleotides:Recent Developments and Therapeutic Applications.Bioconjug.Chem.2019；Contemporary Approaches to Site
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Selective Protein Modification.Nat.Rev.Chem.2019)。这些化学反应为后续分析通常依赖的多种操作、分类和标记实验奠定了基础。
[0004]然而，这些方法的重点始终是在靶标生物分子和必需的功能部分之间建立稳定的联系。因此，官能化可以将生物分子的研究限制在单一的分析过程中。这种方法与最近的细胞生物学研究(其中观察细胞行为的综合方法变得越来越重要)不一致。
[0005]最近为解决一个或更多个这些问题做出的努力包括以下现有技术。Bernades等已经报道了双功能接头的开发，该接头同时允许位点特异性蛋白质修饰和钯介导的生物正交decaging。这是通过炔丙基氨基甲酸酯接头中的硫醚结合基序和易于获得的钯复合体实现的(Bernades et al.Chem.Sci.,2018,9,4185,Angew.Chem.Int.Ed.Vol 57,36,2018；Chem.Sci.,2016,7,4589
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4593)。
[0006]据报道，在蛋白质的捕获和释放中使用可切割的重氮键作为监测内源性甲基转移酶活性的工具(Lou et.al.,J.Am.Chem.Soc.2012,134,36,14905
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14912)。在标记和捕获之后，可以通过用连二亚硫酸钠切割重氮基团释放蛋白质。
[0007]已经报道了可逆的mTAG标记策略，其中使用紫外线去除标记部分(参见Chem.Commun.,2018,54,449
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451)。光触发的去除是绝对的，其意味着DNA分子的重复标记是必要的。另外，标记部分不包含用于进一步官能化的官能性。
[0008]因此，本专利技术的第一个非排他性目的是提供将生物分子可逆地与第二分子例如标记物连接的生物正交方法。本专利技术的其他非排他性目的之一是提供在无限循环中标记、去标记和重新标记生物分子的生物正交方法，以便可以对单个样品顺序地进行多次分析。本专利技术的其他非排他性目的是提供回收第二或其他分子的生物正交方法。
[0009]因此，本专利技术的第一方面提供了可逆地标记生物分子的方法，该方法包括：
[0010]a.提供接头分子，接头分子包含含有反应中心的第一官能团、含有反应中心的第二官能团和可切割部分例如可水解部分；
[0011]b.在生物分子和第一官能团的反应中心之间形成共价键；
[0012]c.在第一标记物和第二官能团的反应中心之间形成共价键；
[0013]d.切割接头分子的可切割部分，例如水解接头分子的可水解部分以去除第一标记物且且以形成包含反应中心的第三官能团；
[0014]e.在其他分子和第三官能团的反应中心之间形成共价键以重新形成可切割部分，例如可水解部分。
[0015]有利地，本专利技术方法中的接头分子的可切割部分或键，例如可水解部分或键可用于以整合性的方法将官能性位点选择性地写入、修饰、擦除和重写至生物分子上。本专利技术的方法可用于例如材料有限的单细胞分析。通过使用本专利技术的方法以组合多种分析方法，对细胞行为的新的、更全面的理解是可能的。更有利地，在进行了所需的分析之后，可以回收接头分子、标记物和生物分子。
[0016]在一些实施方案中，可切割部分是可水解部分。可水解部分可以是席夫碱，例如亚胺部分、肟部分和/或腙部分。
[0017]在一些实施方案中，可水解键可包含二硫(S
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S)键。
[0018]在一些实施方案中，其他分子可包含含有反应中心的第四官能团。第四官能团可以是与第二官能团之官能团相同的官能团。
[0019]在一些实施方案中，该方法还可以包括步骤f.在第二标记物和第四官能团的反应中心之间形成共价键。在一些实施方案中，该方法还可包括步骤g.切割可切割部分，例如水解可水解部分，例如席夫碱部分，以去除第二标记物并重新形成第三官能团。在一些实施方案中，该方法还可包括步骤h.在其他分子和第三官能团之间形成共价键以重新形成可切割部分，例如可水解部分，例如席夫碱部分。在一些实施方案中，步骤e的其他分子可以与步骤h的种类相同。
[0020]在一些实施方案中，步骤c在步骤b之前进行。在一些替代实施方案中，步骤b在步骤c之前进行。
[0021]在一些实施方案中，步骤b可包括去除离去基团以暴露第一官能团的反应中心的在先或同时的步骤。在一些实施方案中，步骤c可包括去除离去基团以暴露第二官能团的反应中心的在先或同时的步骤。
[0022]在一些实施方案中，其他分子可包含标记物。该方法可包括步骤i.在包含标记物的其他分子和第三官能团之间形成共价键以重新形成可切割部分，例如，可水解部分，例如席夫碱部分。应当理解，该物质可代替本专利技术方法中步骤c的反应产物。例如，可切割部分，例如可水解部分可被水解以去除标记物并且以形成包含反应中心的官能团(例如第三官能团)。该方法还可包括在其他分子和官能团(例如第三官能团)的反应中心之间形成共价键以重新形成可切割部分，例如，可水解部分。
[0023]在一些实施方案中，步骤c、d、e、f和g可以顺序地进行并且在无限循环或封闭循环中重复。有利地，这使得能够用第一标记物、第二标记物和第n标记物顺序地可逆标记生物分子。
[0024]接头分子可具有以下通式：
[0025][0026]其中FG表示包含反应中心的第二官能团；
diphosphate，FPP)衍生物，其用于法尼基转移酶定向标记(参见Distefano et al Chem.Rev.2018)；肉豆蔻酰辅酶A衍生物，其用于N
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肉豆蔻酰转移酶定向标记(参见Distefano et al Chem.Rev.2018)。
[0042]在其他优选的实施方案中，第一官能团LG是S...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.可逆地标记生物分子的方法，所述方法包括：a.提供接头分子，所述接头分子包含含有反应中心的第一官能团、含有反应中心的第二官能团，以及可切割部分，例如可水解部分；b.在所述生物分子和所述第一官能团的反应中心之间形成共价键；c.在第一标记物和所述第二官能团的反应中心之间形成共价键；d.切割所述接头分子的所述可切割部分，例如水解所述接头分子的所述可水解部分，以去除所述第一标记物并且以形成包含反应中心的第三官能团；e.在其他分子和所述第三官能团的反应中心之间形成共价键以重新形成所述可切割部分，例如所述可水解部分。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述其他分子包含第四官能团，例如其中所述第四官能团与所述第二官能团相同。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法还包括步骤f.在第二标记物和所述第四官能团的反应中心之间形成共价键。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法还包括切割所述可切割部分，例如，水解所述可水解部分(例如席夫碱部分)，以去除所述第二标记物并且以重新形成所述第三官能团。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法还包括步骤h.在其他分子和所述第三官能团之间形成共价键以重新形成所述可切割部分，例如所述可水解部分(例如所述席夫碱部分)，步骤e的所述其他分子可与步骤h的种类相同。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述其他分子包含第二标记物。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接头分子包含以下通式：其中FG表示所述包含反应中心的第二官能团；Z表示选自脂族键或芳族键之一的非反应性基团；A
‑
B
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C一起表示所述可切割部分，例如，所述可水解部分(例如所述席夫碱部分)；Y表示选自脂族键或芳族键的非反应性基团；LG表示包含反应中心的第一官能团。8.根据权利要求7所述的方法，其中Z表示聚醚链，例如包含最多5个乙二醇单体的聚乙二醇链。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可切割部分A
‑
B
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C表示以下部分之一：
其中R
x
表示氢原子、氘原子、脂族键或芳族键之一。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物分子是多核苷酸，例如DNA链或RNA链。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接头分子是S
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腺苷
‑
l
‑
甲硫氨酸辅因子的类似物。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b.在所述生物分子和所述第一官能团的反应中心之间形成共价键还包括提供催化剂，例如酶，例如能够从S
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腺苷
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l
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甲硫氨酸辅因子类似物中转移烷基的DNA甲基转移酶。13.根据权利要求11或12中任一项所述的方法，其中所述接头分子具有以下通式：其中FG表示所述第二官能团；
Z表示选自脂族键或芳族键之一的非反应性基团；A
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B
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C表示所...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特，
申请(专利权)人：伯明翰大学，
类型：发明
国别省市：