一种高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备方法及其应用，将缓冲液、琼脂糖混合配置琼脂糖溶液，在蒸汽环境中于高温高压条件下进行溶解，得到琼脂糖溶胶，将玻璃板灌胶器预热后注入琼脂糖溶胶，插入梳子，室温下冷却凝固，得到高浓度琼脂糖电泳凝胶，高浓度琼脂糖电泳凝胶在低分子量核酸分离中的应用。本发明专利技术工艺简单，操作方便，将琼脂糖在蒸汽环境中于高温高压条件下进行溶解，形成均匀的溶胶，在高温环境下灌制、室温冷却凝固得到高浓度琼脂糖电泳凝胶，所得高浓度琼脂糖电泳凝胶在电泳分离低分子量核酸片段时电泳图谱清晰，分辨率高。分辨率高。分辨率高。

【技术实现步骤摘要】
一种高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属生物
，涉及一种电泳分离介质的制备方法及其应用，具体是一种高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备方法及其在低分子量核酸分离中的应用。

技术介绍

[0002]核酸作为生命的最基本物质之一，分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)，其中，DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，因此，针对DNA的研究是生命科学领域中的一个关键点。
[0003]按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，能够用于分离、鉴定和纯化DNA片段(核酸片段)，已经发展成为一种分析鉴定DNA分子的重要实验手段，是基因操作的核心技术之一。
[0004]琼脂糖凝胶因其结构均匀、对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好等优点，已成为实验室凝胶电泳中最常用的分离支持介质，普遍用于分离、鉴定、纯化核酸。目前，实验室中常以常压加热的方式(微波炉加热)制备中低浓度的琼脂糖凝胶(0.6％
‑
3％)，根据“核算分子量越大，电泳时凝胶浓度越小”的规律，中低浓度的琼脂糖凝胶常常被用来分离100bp
‑
20kbp的核酸片段(DNA片段)。但在实验室实际操作过程中，中低浓度的琼脂糖凝胶对于200bp以下的小分子量核酸片段，条带分离度差，分辨率低。因此，小分子量核酸片段的高分辨率分离，需要更高浓度(≥4％)的琼脂糖凝胶。由于琼脂糖自身的特性，高浓度的琼脂糖凝胶难于制备，实验室常常使用聚丙烯酰胺凝胶替代其进行小分量核酸的高分辨率分离，局限了琼脂糖凝胶在小分量核酸的应用，而且，过往的研究也发现，在琼脂糖凝胶中而不是聚丙烯酰胺凝胶中观察到的迁移率准确地反映了核酸分子量，况且核酸分子中如果存在连续的腺嘌呤残基会导致它们在聚丙烯酰胺凝胶中移动缓慢，不能反映它们的真实大小。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术的不足而提供一种高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备方法，在蒸汽环境中于高温高压条件下进行溶解，形成均匀的溶胶，在高温环境下进行琼脂糖凝胶灌制得到高浓度琼脂糖电泳凝胶，解决了常规微波炉加热或煮沸加热方法制备琼脂糖凝胶时，高浓度琼脂糖(6％及以上)难于溶解和产生大量气泡、均匀度差等问题。
[0006]本专利技术所采用的技术方案：
[0007]一种高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备方法，其步骤如下：
[0008]1、配制缓冲液和琼脂糖溶液：在TBE(Tris
‑
硼酸)中加入0.1～0.2％NaCl作为琼脂糖凝胶制备的缓冲液；按浓度为6～16％的琼脂糖凝胶的配制标准，将缓冲液、琼脂糖混合配置琼脂糖溶液；
[0009]2、琼脂糖溶解：将配制好的琼脂糖溶液，在蒸汽环境中于高温高压条件下进行溶解，得到溶解均匀的琼脂糖溶胶；
[0010]所述蒸汽环境中的高温高压条件是：温度为115～121℃，压力为1.6
×
105Pa～2.1
×
105Pa。
[0011]3、琼脂糖电泳凝胶灌制：将玻璃板灌胶器加热至75～85℃进行预热，然后在75～85℃的环境中将冷却至75～85℃的琼脂糖溶胶注入到玻璃板灌胶器中，插入梳子，室温下冷却凝固，得到高浓度琼脂糖电泳凝胶。
[0012]本专利技术的另一个目的在于提供上述高浓度琼脂糖电泳凝胶在低分子量核酸分离中的应用。
[0013]所述低分子量核酸是指500bp以下的小分子量核酸片段。
[0014]所述低分子量核酸是指单链DNA。
[0015]本专利技术工艺简单，操作方便，将琼脂糖在蒸汽环境中于高温高压条件下进行溶解，形成均匀的溶胶，解决了常规微波炉加热或煮沸加热方法制备琼脂糖凝胶时，高浓度琼脂糖(6％及以上)难于溶解和产生大量气泡、结构均匀差等问题，同时，在高温环境下进行琼脂糖凝胶灌制得到高浓度琼脂糖电泳凝胶，解决了高浓度琼脂糖凝胶室温灌制时迅速凝固，结构均匀度差的问题，所得高浓度琼脂糖电泳凝胶在电泳分离低分子量核酸片段时电泳图谱清晰，分辨率高。
附图说明
[0016]图1是本专利技术的高浓度琼脂糖溶胶溶解效果。A：100ml凝胶缓冲液中加入6g、8g、10g、12g、14g、16g琼脂糖后的状态；B：加压加温溶解后的溶胶状态。
[0017]图2不同浓度的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶对DNA片段的电泳分离效果。A：琼脂糖凝胶对DNA片段的分离；B：聚丙烯酰胺凝胶对DNA片段的分离。Marker为80
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300bp的商品化DNA分子量标准，59bp至204bp的DNA片段来源于对HptII基因ORF区域对应长度的扩增。
[0018]图3高浓度琼脂糖凝胶对单链DNA的分离效果。A：10％的琼脂糖凝胶电泳；B：12％的琼脂糖凝胶电泳；C：14％琼脂糖凝胶电泳；D：14％PAGE凝胶电泳。Marker为80
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300bp的商品化DNA分子量标准，19b至93b的单链DNA分子由上海生工生物工程公司合成。
具体实施方式
[0019]下面结合实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0020]一、高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备
[0021]实施例：
[0022]S1、配制缓冲液和琼脂糖溶液：1
×
TBE中加入0.1％NaCl作为琼脂糖凝胶制备的缓冲液；根据6％、8％、10％、12％、14％、16％的凝胶浓度计算琼脂糖和缓冲液的用量，分别配置琼脂糖溶液，置于试剂瓶中(图1A)。
[0023]S2、琼脂糖溶解：分别将已配制好琼脂糖溶液的试剂瓶放入高压灭菌器中，设置温度为115～121℃(对应压力为1.6
×
105Pa～2.1
×
105Pa)，其中，6％、8％的琼脂糖溶液设置温度为116℃，10％、12％、14％、16％琼脂糖溶液设置温度为121℃。加热20min，待高压灭菌器降温到75～85℃时取出试剂瓶，可见琼脂糖已溶解形成均匀的琼脂糖溶胶(图1B)。
[0024]S3、琼脂糖电泳凝胶灌制：将玻璃板灌胶器放入电加热箱中，于75～85℃预热，然后在电加热箱(控制温度在75～85℃)中，将琼脂糖溶胶注入到玻璃板灌胶器中，插入梳子，取出玻璃板灌胶器，放置于室温下冷却凝固(大约30分钟)，得到浓度分别为6％、8％、10％、12％、14％、16％的高浓度琼脂糖电泳凝胶(不同厂家生产的玻璃板灌胶器的内孔规格会有所不同，因此，凝胶规格也会有所不同)。
[0025]二、不同浓度琼脂糖电泳凝胶对低分子量核酸的分离效果
[0026]1、分别取长约14cm，浓度分别为6％、8％、10％的琼脂糖电泳凝胶，样品(Marker、59bp至204bp的DNA片段)上样，140V(按10V/cm的凝胶长度计算)进行电泳(凝胶浓度越大，需要的电泳时间越长)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备方法，其特征在于，其步骤如下：1)配制缓冲液和琼脂糖溶液：在TBE中加入0.1～0.2％NaCl作为琼脂糖凝胶制备的缓冲液；按浓度为6～16％的琼脂糖凝胶的配制标准，将缓冲液、琼脂糖混合配置琼脂糖溶液；2)琼脂糖溶解：将配制好的琼脂糖溶液，在蒸汽环境中于高温高压条件下进行溶解，得到溶解均匀的琼脂糖溶胶；3)琼脂糖电泳凝胶灌制：将玻璃板灌胶器加热至75～85℃进行预热，然后在75～85℃的环境中将冷却至75～85℃的琼脂糖溶胶注入到玻璃板灌胶器中，插入梳子，室温下冷却凝固，得到高浓度琼脂糖电...

【专利技术属性】
技术研发人员：仝征，彭存智，常丽丽，王丹，黄超，徐兵强，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：