一种牛角特征肽段及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种牛角特征肽段，本发明专利技术通过大量实验筛选，筛选出Ala

【技术实现步骤摘要】
一种牛角特征肽段及其检测方法


[0001]本专利技术涉及一种动物药的检测鉴别方法，具体涉及牛角特征肽段及其检测方法，这些特征肽可用于区分水牛角、牦牛角及黄牛角样品。

技术介绍

[0002]水牛角Bubali Cornu为牛科动物水牛Bubalus bubalis Linnaeus的角，始载于《名医别录》：“疗时气寒热头痛”，性味苦咸、寒，具清热、解毒、凉血、定惊之功效，是中医临床及中药制药行业的重要品种。现代研究表明水牛角具有良好的解热、镇静等功效，目前中医临床及中药制药行业以水牛角替代犀角应用于方剂及中成药：清营汤、犀角汤、犀角地黄汤等均以水牛角替代犀角，这些方剂在清热解毒、定惊凉血等方面均取得了较好的疗效。
[0003]水牛角物质基础研究表明，蛋白质类、肽类、氨基酸类、甾醇类、核苷类、无机元素类等为其主要成分。水牛角质量标准并不完善，水牛角药材、浓缩粉、含水牛角的成方制剂缺少专属性鉴别、含量测定的方法，药材市场存在以其它角类或蹄甲混售的现象，尤其对于近缘物种掺假混售情况仍缺少适合的鉴别检测方法，如以黄牛角、牦牛角等掺入水牛角售卖。有研究表明基于COI序列的DNA条形码技术可用于鉴别水牛角药材混伪品，但是中药高温提取过程会影响DNA的完整性，进而影响DNA条形码鉴定的准确性，相较于DNA分子，蛋白质、肽类成分的一级序列信息在高温提取条件下保存较好。如I型角蛋白(Keratin,type I)、II型角蛋白(Keratin,type II)等角蛋白类成分为角类动物药重要物质基础，水牛、牦牛、黄牛属近缘物种，其角蛋白等蛋白质类成分序列相似度极高，因此无法通过物种专属肽的“有”或“无”区分三者，基于此，本专利技术依据个别特征肽类在三者中相对含量的高低可加以区分。因而本专利技术通过检测3个牛角特征肽段来区分水牛角、牦牛角及黄牛角，该方法为水牛角质量研究提供了参考与依据，有利于水牛角及其制品质量标准进一步完善。

技术实现思路

[0004]本专利技术主要目的是针对上述存在的问题与不足，提供一种牛角特征肽段及牛角特征肽段的检测方法。本专利技术提供的牛角特征肽段专属性强。提供的方法操作简单，灵敏度高，能准确区分水牛角、牦牛角、黄牛角，为保证水牛角及其制品的质量提供科学方法。
[0005]技术方案：为了实现以上目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0006]一种牛角特征肽段，所述的特征肽序列如序列表1：
[0007]肽1：Ala
‑
Ile
‑
Gly
‑
Cys
‑
Gly
‑
Phe
‑
Gly
‑
Ser
‑
Ser
‑
Gly
‑
Gly
‑
Ser
‑
Ser
‑
Ser
‑
Thr
‑
Ile
‑
Lys；
[0008]肽2：Thr
‑
Cys
‑
Gly
‑
Phe
‑
Ser
‑
Thr
‑
Val
‑
Gly
‑
Ser
‑
Gly
‑
Phe
‑
Gly
‑
Ser
‑
Arg；
[0009]肽3：Ser
‑
Asp
‑
Leu
‑
Glu
‑
Ala
‑
Glu
‑
Val
‑
Glu
‑
Ser
‑
Leu
‑
Lys。
[0010]一种牛角特征肽段的检测方法，包括以下步骤：
[0011](1)将3个牛角特征肽段配成混合对照品溶液；
[0012](2)将待检测角类动物药样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)牛角
特征肽段混合对照品溶液注入液质联用仪，以牛角特征肽段为对照，采用多反应监测模式，选择的母离子包括：特征肽1：m/z 786.9
→
694.8(DP＝106.94，CE＝39.82)、特征肽2：m/z710.4
→
667.2(DP＝98.91，CE＝33.24)、特征肽3：m/z 610.4
→
775.4(DP＝95.98，CE＝27.99)进行检测；根据检测出上述离子情况对水牛角、牦牛角、黄牛角进行区分。
[0013]作为优选方案，所述的牛角特征肽段的检测方法，含有肽1和肽3，不含肽2的样品为水牛角；牦牛角中均可检测到3个特征肽段，其中A
特征肽
‑1/A
特征肽
‑2的值不高于0.20；A
特征肽
‑1/A
特征肽
‑3的值不高于0.80；黄牛角中均可检测到3个特征肽段，A
特征肽
‑1/A
特征肽
‑2值不低于39.00；A
特征肽
‑1/A
特征肽
‑3的值不低于54.00。
[0014]作为优选方案，以上所述的牛角特征肽段的检测方法，所述的酶切方法如下进行：取待检测角类动物药样品20mg，加入1ml蛋白裂解液，至于水浴过夜，离心，取上清液，加入IAA溶液，避光放置，加入冷丙酮溶液，充分混匀后，冷藏，沉淀过夜；
[0015]取丙酮沉淀样品离心后，弃去上清，用冷丙酮洗涤沉淀两次，挥干沉淀，加入尿素溶液复溶，充分振摇，待沉淀完全溶解后加入Tris
‑
HCl缓冲液，在各个角类样品中分别加入胰蛋白酶，恒温水浴孵育，即得。
[0016]作为优选方案，以上所述的牛角特征肽段的检测方法，所述的酶切方法如下进行：取待检测角类动物药样品20mg，加入1ml蛋白裂解液(蛋白裂解液包括4％SDS，20mM DTT，50mM Tris
‑
HCl，pH＝8.8)；然后至于65℃水浴过夜，10000rpm离心20min，取上清液200μl，加入50μl 0.2M IAA(碘乙酰胺)溶液，避光放置30min，加入1ml 80％冷丙酮溶液，充分混匀后至于
‑
20℃冷冻沉淀过夜；
[0017]取丙酮沉淀样品，经过10000rpm离心20min后，弃去上清，用80％冷丙酮洗涤沉淀两次，挥干沉淀，加入200μl 8M尿素溶液复溶，充分振摇，待沉淀完全溶解后加入1400μl Tris
‑
HCl缓冲液，使尿素浓度降至1M以下，在各个角类样品中分别加入0.1μg/μl的胰蛋白酶30μl，37℃恒温水浴孵育12h，即得。
[0018]作为优选方案，以上所述的牛角特征肽段的检测方法，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm
×...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛角特征肽段，其特征在于，所述的特征肽为：肽1：Ala
‑
Ile
‑
Gly
‑
Cys
‑
Gly
‑
Phe
‑
Gly
‑
Ser
‑
Ser
‑
Gly
‑
Gly
‑
Ser
‑
Ser
‑
Ser
‑
Thr
‑
Ile
‑
Lys；肽2：Thr
‑
Cys
‑
Gly
‑
Phe
‑
Ser
‑
Thr
‑
Val
‑
Gly
‑
Ser
‑
Gly
‑
Phe
‑
Gly
‑
Ser
‑
Arg；肽3：Ser
‑
Asp
‑
Leu
‑
Glu
‑
Ala
‑
Glu
‑
Val
‑
Glu
‑
Ser
‑
Leu
‑
Lys。2.一种牛角特征肽段的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求1所述的3个牛角特征肽段配成混合对照品溶液；(2)将待检测角类动物药样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)牛角特征肽段混合对照品溶液分别注入液质联用仪，以牛角特征肽段为对照，采用多反应监测模式，选择的MRM条件为：特征肽1：m/z 786.9
→
694.8，DP＝106.94，CE＝39.82、特征肽2：m/z 710.4
→
667.2，DP＝98.91，CE＝33.24、特征肽3：m/z 610.4
→
775.4，DP＝95.98，CE＝27.99进行检测；根据检测出上述离子情况对水牛角、牦牛角、黄牛角进行区分。3.根据权利要求2所述的牛角特征肽段的检测方法，其特征在于，含有肽1和肽3，不含肽2的样品为水牛角；牦牛角中均可检测到3个特征肽段，其中A
特征肽
‑1/A
特征肽
‑2的值不高于0.20；A
特征肽
‑1/A
特征肽
‑3的值不高于0.80；黄牛...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘睿，段金廒，钱大玮，赵明，郭盛，朱悦，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：