一种获得四倍体艾纳香不定芽的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得四倍体艾纳香不定芽的方法，即选用二倍体艾纳香的根切段作为外植体，以含有0.025～0.1mg/L NAA、1.0～2.0mg/L 6

【技术实现步骤摘要】
一种获得四倍体艾纳香不定芽的方法


[0001]本专利技术属于植物多倍体育种
，具体涉及一种获得四倍体艾纳香不定芽的方法。

技术介绍

[0002]艾纳香(Blumea balsamifera(L.)DC.)是菊科艾纳香属多年生草本植物，分布于我国云 南、贵州、海南、中国台湾等地，是中药艾片(左旋龙脑)的唯一来源植物，其提取物是多 种中成药的主要原料，并广泛应用于食品、药妆等市场领域，具有良好的市场前景。
[0003]长期以来，艾纳香种植技术相对落后，良种种苗扩繁是主要难点。艾纳香在生产上以种 子繁殖和分根繁殖为主，种子繁殖属于有性繁殖，缺点在于出苗率低，且后代性状分离，无 法保持原有种性。分根繁殖属于无性繁殖，缺点在于无法排除原有植株的病原体，且效率低 下。因此，有必要开展艾纳香种苗的离体扩繁研究。艾纳香作为药用植物，其药效成分左旋 龙脑属于其次生代谢物，多倍体育种有利于促进其次生代谢物包括左旋龙脑的积累，因此多 倍体育种是艾纳香生物技术育种的重要方向。
[0004]前人对艾纳香染色体加倍技术进行多尝试，主要是基于诱导腋芽染色体加倍。但是，该 技术存在根本性的缺陷。诱导腋芽增殖是最常用的艾纳香种苗快繁技术，其通过刺激植株原 有的侧芽生长点生长，达到扩繁的目的，不涉及细胞脱分化过程。如果试图用此方式进行人 工诱变或转基因，得到嵌合体的几率会很高，因为，构成原有的芽的复数细胞很难全部变异 或得到转化，两种细胞将混杂在一起，从而产生嵌合体。嵌合体在生长过程中，会发生性状 不稳定和性状消失的问题，导致育种工作失败。
[0005]在现有技术中，处理的是腋芽，即处理的芽是已经存在的、已完成芽分化的腋芽，因此 在人工诱导其染色体加倍的过程中，只能作用于正在有丝分裂的细胞，对前期已经完成了有 丝分裂的细胞，如果其不继续有丝分裂，就不能刺激其染色体加倍。因此，会造成处理不完 全的情况，即不能使整个处理对象的所有细胞完全加倍，所获得的芽体中既有加倍的四倍体 细胞，又有未加倍的二倍体细胞的情况，即嵌合体。嵌合体植株在成长和繁殖过程中，很容 易因为多倍体细胞和二倍体细胞生长发育趋势差异而出现多倍体植株退化成二倍体植株的情 况，因此，现有技术难以满足目前艾纳香的育种需求。
[0006]另一种可能尝试的技术，是使用叶片外植体，先使用一种培养基诱导产生二倍体愈伤组 织，然后人工诱导技术，诱导二倍体愈伤组织细胞加倍为四倍体愈伤组织，再转移到另一种 培养基，诱导四倍体愈伤组织分化形成四倍体不定芽。目前尚未有文件报道这种技术在艾纳 香多倍体育种方面的成功应用。通常，人工诱变在愈伤组织阶段进行，但由于部分未成功诱 变的细胞同样可能分化形成不定芽，因此该过程同样存在嵌合体的问题。此外，这种技术需 要经过三个步骤，配制至少三种培养基，接种至少三次，培养至少三个阶段，因此不仅过程 繁琐，而且还存在一定几率、偶发于愈伤组织阶段的非目的性变异，干扰诱变或遗传转化结 果。
[0007]鉴于此，目前仍缺乏一种不会产生嵌合体或嵌合体率较低，且过程简便的获得四
倍体艾 纳香不定芽的组织培养方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是为了克服现有艾纳香四倍体技术仅选择二倍体植株带芽茎段(主要利用 其中已存在的顶芽和腋芽)作为外植体，通过刺激定芽(顶芽和腋芽)细胞加倍获得四倍体 不足，提供一种用二倍体艾纳香的根作为外植体材料，诱导根细胞同时加倍和直接分化产生 不定芽的方法。本专利技术不需要借助已有的定芽(顶芽或腋芽)，而是由体细胞直接加倍并分 化为不定芽。本专利技术的好处是每一个细胞都可以独立直接地形成一个芽，不会产生大量异质 细胞混杂的嵌合体，从而提高了定向诱变或遗传转化的准确性，不仅是获得完全四倍体的技 术基础，而且为艾纳香人工诱变、转基因等育种工作提供技术参考。
[0009]本专利技术的第一个目的是提供一种诱导二倍体艾纳香体细胞同时加倍为四倍体并直接分化 产生四倍体不定芽的方法。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供二倍体艾纳香根部组织在不经过愈伤组织阶段，直接分化为 四倍体不定芽的技术中的应用。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0012]本专利技术要求保护一种获得四倍体艾纳香不定芽的方法，利用二倍体艾纳香的根外植体直 接诱导加倍并分化形成四倍体不定芽。该组培方法获得再生芽的来源是作为外植体的二倍体 艾纳香根部；该组培方法只配制一种培养基，接种一次，培养一个周期即可获得四倍体再生 芽，完成艾纳香的体细胞分化不定芽过程，达到染色体加倍的效果。
[0013]该方法包括以下步骤：以二倍体艾纳香的根为外植体，将根切成段后，以含有0.025～0.1 mg/L NAA、1.0～2.0mg/L 6
‑
BA和90～150mg/L秋水仙素的加倍培养基进行培养。
[0014]优选的，所述加倍培养基为在基础培养基中添加了0.025～0.1mg/L NAA、1.0～2.0mg/L6
‑
BA、90～150mg/L秋水仙素、10～70g/L蔗糖和2～8g/L琼脂。
[0015]优选的，所述根包括定根或不定根。
[0016]优选的，培养时间为20～60d。
[0017]优选的，根切成段后，根段的长度大于2cm。
[0018]更优选的，根切成段后，根段的长度为4～8cm。长度偏短的时候，诱导产生不定芽的效 率较低。长度较长的时候，诱导产生不定芽的效率较高。但是长度太长的时候，同样数量的 根能得到的外植体数量就偏少。
[0019]优选的，所述基础培养基为1/2MS培养基或MS培养基。
[0020]更优选的，所述加倍培养基为在基础培养基中添加了0.05mg/L NAA、1.0mg/L 6
‑
BA、 120mg/L秋水仙素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0022](1)本专利技术克服了此前仅选择带芽茎段作为外植体，通过定芽(顶芽和腋芽)增殖并诱 导加倍的不足，提供一种用艾纳香的根作为外植体材料，一步诱导根细胞直接加倍并同时分 化产生四倍体不定芽的方法，填补了艾纳香的根作为艾纳香多倍体育种外植体材料的空白。 本专利技术的应用结果显示，艾纳香的根不仅可以作为增殖和加倍的外植体，甚至还是作为更好 的外植体选择可选项。使用根外植体，增加了可培养的外植体材料对象，即
增加了艾纳香在 生物技术育种过程中有效外植体来源。
[0023](2)可以使二倍体艾纳香根细胞直接加倍并同时分化形成四倍体不定芽，比现有技术更 简便快捷，且减少了嵌合体的产生；
[0024](3)本专利技术节省了耗材、时间和人力成本，并提高了艾纳香定向诱变或遗传转化的准确 性，为艾纳香人工诱变、细胞工程育种提供技术基础。
附图说明
[0025]图1艾纳香根外植体诱导四倍体艾纳香不定芽效果图
具体实施方式
[0026]为了更好理解本专利技术技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得四倍体艾纳香不定芽的方法，其特征在于，包括以下步骤：以二倍体艾纳香的根为外植体，将根切成段后，以含有0.025～0.1mg/L NAA、1.0～2.0mg/L 6
‑
BA和90～150mg/L秋水仙素的加倍培养基进行培养。2.根据权利要求1所述获得四倍体艾纳香不定芽的方法，其特征在于，所述加倍培养基为在基础培养基中添加了0.025～0.1mg/L NAA、1.0～2.0mg/L 6
‑
BA、90～150mg/L秋水仙素、10～70g/L蔗糖和2～8g/L琼脂。3.根据权利要求1所述获得四倍体艾纳香不定芽的方法，其特征在于，所述根包括定根或不定根。4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓鹭，王丹，于福来，元超，杨永，肖永锋，罗沁，黎玉兰，陈振夏，陈英桦，于平，官玲亮，张影波，黄梅，谢小丽，王凯，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：