一种产酸菌JC-C及其应用与产酸菌JC-C的培养、鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种产酸菌JC

【技术实现步骤摘要】
一种产酸菌JC
‑
C及其应用与产酸菌JC
‑
C的培养、鉴定方法


[0001]本专利技术属于环境微生物
，涉及一种产酸菌JC
‑
C及其应用，还涉及该产酸菌JC
‑
C的培养、鉴定方法。

技术介绍

[0002]新中国成立后，我国矿产资源勘查和开发得到了巨大的发展，为国民经济建设打下了坚实的基础。采矿业一般作为矿区当地的重要经济支柱，为当地经济建设与社会发展提供有力的支持；同时随着矿产资源的开发、运输及冶炼加工，带来的土壤污染问题日益严重，其中重金属土壤污染危害最大、治理困难而日渐受到人的关注。重金属通常以稳定状态存在于环境之中，但是由于采矿生产，原本存在于深层土壤、矿山中的重金属被输送至地表,并随着水循环水扩散到整个生态环境中，已经严重威胁到当地居民的生命健康。
[0003]目前矿区土壤污染修复技术主要是物理修复技术、化学修复技术。随着科学技术的日益发展近几年对矿区土壤的微生物修复技术也成为了一项重要手段，其主要原理即在重金属污染区筛选提取具有高重金属抗性的微生物并加以培养，利用其生命代谢活动及代谢分泌产生的有机酸对土壤中重金属进行螯合、溶解等方式减少土壤中重金属毒性。这种新兴的修复方法相较于传统修复方法具有运行成本低，效果显著，对环境友好等特点，日渐被国内外重视及运用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种产酸菌JC
‑
C及其应用与产酸菌JC
‑
C的培养、鉴定方法，为生物产酸并改良尾矿随意处理导致周边区域重金属污染土壤问题提供了菌种资源。
[0005]本专利技术所采用的技术方案是，一种产酸菌JC
‑
C，该菌株命名为：产黄青霉(Penicillium chrysogenum)，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：21423。
[0006]产酸菌JC
‑
C的培养方法，具体为：
[0007]步骤1、菌株的分离培养
[0008]采集受重金属污染严重的土壤作为样品；
[0009]制备查式培养基：将蔗糖30g、NaNO33.0g、K2HPO41.0g、KCl 0.5g， FeSO4·
7H2O 0.01g、琼脂20.0g、蒸馏水1L，混合后，于121℃高温灭菌20 min，接着倒平板待其凝固，制成无菌的查式培养基，用来进行分离培养；
[0010]将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养3
‑
5d；
[0011]步骤2、鉴别产酸菌株
[0012]制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入查式固体培养基中，在 121℃高温灭菌20min，倒平板待其凝固后制成无菌的产酸鉴别培养基备用，其颜色为紫色；
[0013]将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落培养于产酸鉴别
培养基；
[0014]培养3
‑
5d后培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑选具有产酸能力的菌株多次接种于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；
[0015]当添加重金属的查式培养基中，添加Zn
2+
浓度高于400mg/L，或Pb
2+
浓度高于2000mg/L，或Cd
2+
浓度高于200mg/L时，才会对产酸菌JC
‑
C产生严重抑制作用。
[0016]产酸菌JC
‑
C在产酸中的应用，利用发酵培养基测定产酸菌JC
‑
C的产酸效率，所述发酵培养基采用蔗糖100.0g，NaNO31.5 g，KH2PO40.5 g，KCl 0.025g，MgSO4·
7H2O 0.025g，酵母浸膏1.6g，调节pH为4，于121℃灭菌20min；
[0017]向培养后产酸菌JC
‑
C培养基中加入无菌水，用无菌涂布棒，轻轻刮菌落表面，获得菌株孢子，再通过血球计数板观察孢子数量，加无菌水，将菌株孢子稀释孢子，按3.6
×
106个/50ml的比例加入发酵培养基进行恒温震荡培养，于温度为30℃、转速为160rpm条件下在恒温振荡培养箱中进行培养。
[0018]产酸菌JC
‑
C的鉴定方法，包括：利用18S rRNA基因序列对菌种鉴定和发酵液中有机酸含量的测定。
[0019]利用18S rRNA基因序列对菌种鉴定具体为：
[0020]目标菌株18S rRNA基因序列的PCR扩增：
[0021]通过真菌通用引物ITS1(5
′‑
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
‑3′
)和 ITS4(5
′‑
TCCTCCGCTTATTGATATGC
‑3′
)进行PCR扩增。在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目标菌株的 18S rRNA基因序列。
[0022]发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定具体为：
[0023]首先进行0.1mol/LNaOH标准溶液、1％酚酞指示剂的配置。然后准确吸取10.0mL样品发酵液，转移到100mL容量瓶中，加蒸馏水至100mL刻度并摇匀。用滤纸过滤，准确吸取滤液20mL放入100mL三角瓶中，加入1％酚酞2滴，用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至初显粉色在0.5min内不褪色为终点，记下氢氧化钠用量，重复取三次取平均值。并测定空白组消耗 NaOH的含量。
[0024]本专利技术的有益效果是：
[0025]产酸菌JC
‑
C的耐重金属效果：
[0026]当添加重金属的查式培养基中，采用打孔器接菌的方式，于30℃培养真菌，观察其菌株抑制率。抑制率(％)＝(空白平板直径
‑
重金属平板直径)/(空白直径
‑
3mm)。当添加重金属Zn
2+
浓度高于400mg/L，或Pb
2+
浓度高于2000 mg/L，或Cd
2+
浓度高于200mg/L时，才会对产酸菌JC
‑
C产生严重抑制作用。
[0027]产酸菌JC
‑
C的耐重金属胁迫的产酸能力：
[0028]未进行重金属处理时，产酸菌JC
‑
C培养液初始pH值为5.44，产酸菌 JC
‑
C培养15h后培养液pH值降至最小值4.58，菌株培养液pH值下降了 0.86；重金属胁迫下，随重金属浓度的增加，产酸菌JC
‑
C的初始培养液pH 值降低、pH的变化幅度变小，培养液在发酵后期出现pH上升趋势。菌株 JC
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产酸菌JC
‑
C，其特征在于，该菌株命名为：黄青霉(Penicillium chrysogenum)JC
‑
C，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：21423。2.根据权利要求1所述的产酸菌JC
‑
C的培养方法，其特征在于，具体方法为：步骤1、菌株的分离培养采集受重金属污染严重的土壤作为样品；制备查式培养基：将蔗糖30g、NaNO
3 3.0g、K2HPO
4 1.0g、KCl 0.5g，FeSO4·
7H2O 0.01g、琼脂20.0g、蒸馏水1L，混合后，于121℃高温灭菌20min，接着倒平板待其凝固，制成无菌的查式培养基，用来进行分离培养；将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养3
‑
5d；步骤2、鉴别产酸菌株制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入查式固体培养基中，在121℃高温灭菌20分钟，倒平板待其凝固后制成无菌鉴别培养基备用，其颜色为紫色；将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落划线培养于产酸鉴别培养基；培养3
‑
5d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑取具有产酸能力的菌株多次划线于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；3.根据权利要求1所述的产酸菌JC
‑
C在产酸中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用发酵培养基测定产酸菌JC
‑
C的产酸效率，所述发酵培养基采用蔗糖100.0g，NaNO
3 1.5 g，KH2PO40.5g，KCl 0.025g，MgSO4·
7H2O 0.025g，酵母浸膏1.6g，调节pH为4、于121℃灭菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：高天鹏，王雪莹，申圆圆，张九东，李广文，胡有宁，李海娟，杨建军，左明博，刘圆，赵敏娟，李肖肖，
申请(专利权)人：西安文理学院，
类型：发明
国别省市：