一种用于骨组织和骨软组织的冻存液和冻存方法技术

本发明专利技术属于组织冻存技术领域，具体涉及一种用于骨组织和骨软组织的冻存液和冻存方法。本发明专利技术针对骨组织和骨软组织提供了一种新的冻存液，还提供了利用上述冻存液对骨组织和骨软组织进行冻存的方法。本发明专利技术特别适用于骨组织和骨软组织的冻存，能够有效降低冻存液中低温保护剂对细胞的毒性，提高细胞存活率，减少对细胞和组织的损伤，从而有利于延长体外骨组织和骨软组织的保存时间，具有很好的应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于骨组织和骨软组织的冻存液和冻存方法


[0001]本专利技术属于组织冻存
，具体涉及一种用于骨组织和骨软组织的冻存液和冻存方法。

技术介绍

[0002]临床中，由创伤、感染、骨肿瘤切除等各种原因导致的骨缺损是骨科治疗的难题之一，骨移植是其首选的治疗方法。虽然自体骨移植是骨缺损修复的“金标准”，但因取骨导致患者创伤增加，且取骨量有限，限制了其在临床中的应用。同种异体骨来源广泛，产生排斥反应小，不存在二次伤害，解决了自体骨移植组织来源不足的问题，因而临床应用日渐广泛。而如何将从供体取下来的异体骨及骨软组织在体外进行长时间保存，且具有良好的细胞活性，成为众学者争相研究的焦点。
[0003]现有的冻存方法主要包括程序化法和玻璃化法。程序化法耗时长、细胞内易产生冰晶。而玻璃化法可以避免产生细胞内冰晶，且操作简单，成为近年来冻存研究的热点，然而影响其玻璃化法冻存效果的因素很多，目前还未形成统一规范的方法。特别是冻存液，其对冻存效果起到了至关重要的作用。低温保护剂是冻存液中的重要组成部分，能够保护细胞不被低温损伤。
[0004]然而，低温保护剂通常是具有毒性的物质。因此，如何设计冻存液的配方，以及如何设置冻存细胞的方法，尽可能降低低温保护剂对细胞的毒性是冻存细胞领域中重要的研究课题。中国专利技术专利申请“CN201910853381.0一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及冻存免疫细胞的方法”针对免疫细胞提出了一种冻存液和方法，通过合理的配方设计，尽可能地减少了低温保护剂二甲基亚砜或乙二醇的使用，降低了冻存液的毒性，提高了细胞存活率。
[0005]对于骨组织及骨软组织的冻存，现有的冻存液和冻存方法均存在毒性过强、细胞存活率较低的问题，因而还需要针对骨组织及骨软组织开发新的冻存液和冻存方法。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的缺陷，本专利技术提供一种用于骨组织和骨软组织的冻存液和冻存方法，其目的在于：通过优化冻存液的配方和冻存方法，降低冻存液的毒性，提供冻存细胞的存活率。
[0007]一种用于骨组织和/或骨软组织的冻存液，每1000ml所述冻存液由如下组分构成：
[0008]KOH 80
‑
120mmol、
[0009]HCl 40
‑
80mmol、
[0010]NaHCO
3 10
‑
50mmol、
[0011]NaH2PO
4 0.8
‑
1.2mmol、
[0012]MgSO
4 0.8
‑
1.2mmol、
[0013]CaCl
2 0.8
‑
1.2mmol、
[0014]葡萄糖2
‑
8mmol、
[0015]TES 80
‑
120mmol、
[0016]1,2丙二醇80
‑
120ml、
[0017]99.9％二甲基亚砜80
‑
120ml，
[0018]余量为水。
[0019]优选的，每1000ml所述冻存液由如下组分构成：
[0020]KOH 100mmol、
[0021]HCl 60mmol、
[0022]NaHCO3 30mmol、
[0023]NaH2PO4 1mmol、
[0024]MgSO4 1mmol、
[0025]CaCl2 1mmol、
[0026]葡萄糖5mmol、
[0027]TES 100mmol、
[0028]1,2丙二醇100ml、
[0029]99.9％二甲基亚砜100ml，
[0030]余量为去离子水。
[0031]优选的，所述冻存液的pH为7.3
‑
7.5。
[0032]本专利技术还提供上述冻存液在冻存骨组织和/或骨软组织中的用途。
[0033]本专利技术还提供一种用于骨组织和/或骨软组织的冻存方法，包括如下步骤：
[0034]步骤1，配制上述冻存液；
[0035]步骤2，将待冻存的组织在冻存液中以0
‑
4℃放置1
‑
3小时；
[0036]步骤3，将待冻存的组织和冻存液逐步降温冷冻至
‑
70～
‑
90℃，放置8
‑
12 小时，然后于液氮中保存。
[0037]优选的，步骤2中，将待冻存的组织放入冻存液中之前，先采用磷酸盐缓冲液清洗3
‑
5次。
[0038]优选的，步骤3中，逐步降温的速度为
‑
0.1～
‑
0.3℃/min。
[0039]本专利技术中，“TES”为化合物2
‑
[[三(羟甲基)甲基]氨基]乙磺酸。
[0040]本专利技术针对骨组织和骨软组织优化了冻存液的组成，仅使用了二甲亚砜一种低温保护剂，将低温保护剂对细胞的损伤降至最低。此外，本专利技术还对冻存方法进行了改进，不进行快速的升温或降温，利用低温保护剂二甲基亚砜的毒性随温度的降低而减小的特点，在保存骨组织或骨软组织时，逐渐降温，最终使组织细胞在低温下载入足够多的二甲基亚砜，实现玻璃化。这进一步降低了二甲亚砜对细胞的损伤。可见，本专利技术不仅提供了一种新的用于骨组织和骨软组织冻存的冻存液，还将该冻存液对细胞的损伤降至最低，能够有效提高骨组织和骨软组织的冻存效果，延长体外骨组织和骨软组织的保存时间，以便于建立骨组织和骨软组织库，扩大同种异体骨移植在修复骨缺损的临床应用。因而，本专利技术具有很好的应用前景。
[0041]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0042]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说
明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
附图说明
[0043]图1为实验例1中冻存细胞的存活率的实验结果；
[0044]图2为实验例1中按照实施例3的冻存液和冻存方法冻存的骨组织和软骨组织的HE染色图像；
[0045]图3为实验例1中按照对比例1的冻存液和冻存方法冻存的骨组织和软骨组织的HE染色图像。
具体实施方式
[0046]以下实施例和实验例中，未特别说明的试剂和材料均为市售品。
[0047]实施例1
[0048]本专利技术骨组织和骨软组织冻存液，每1000ml含KOH 80
‑
120mmol、 HCl 40mmol、NaHCO
3 10mmol、NaH2PO
4 0.8mmol、MgSO
4 0.8mmol、 CaCl
2 0.8mmol、葡萄糖2mmol、TES本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于骨组织和/或骨软组织的冻存液，其特征在于，每1000ml所述冻存液由如下组分构成：KOH 80
‑
120mmol、HCl 40
‑
80mmol、NaHCO
3 10
‑
50mmol、NaH2PO
4 0.8
‑
1.2mmol、MgSO
4 0.8
‑
1.2mmol、CaCl
2 0.8
‑
1.2mmol、葡萄糖2
‑
8mmol、TES 80
‑
120mmol、1,2丙二醇80
‑
120ml、99.9％二甲基亚砜80
‑
120ml，余量为水。2.按照权利要求1所述的冻存液，其特征在于，每1000ml所述冻存液由如下组分构成：KOH 100mmol、HCl 60mmol、NaHCO3 30mmol、NaH2PO4 1mmol、MgSO4 1mmol、CaCl2 1mmol、葡萄糖5mmol、TES 100mmol、1,...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄石书，冉力瑜，龙丹，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：