一种利用ISSR引物鉴别黑鲷真鲷杂交子代的分子标记方法技术

本发明专利技术涉及一种利用ISSR引物鉴别黑鲷真鲷杂交子代的分子标记方法，包括利用1个ISSR分子标记对黑鲷及2个杂交子代新品系的个体进行PCR扩增，根据对PCR产物的电泳条带检测，区分来自黑鲷真鲷杂交子代的个体。本发明专利技术方法操作简便，费用低，准确度高且通用性好，能快速、有效地鉴别基于黑鲷真鲷亲本组合所得的杂交种新品系，为黑鲷杂交新品种选育研究的新种质鉴别研究提供技术帮助。鉴别研究提供技术帮助。鉴别研究提供技术帮助。

【技术实现步骤摘要】
一种利用ISSR引物鉴别黑鲷真鲷杂交子代的分子标记方法


[0001]本专利技术属于鉴别黑鲷领域，特别涉及一种利用ISSR引物鉴别黑鲷真鲷杂交子代的分子标记方法。

技术介绍

[0002]ISSR(inter
‑
simple sequence repeat)分子标记的基本原理是：用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2
‑
4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增，所扩增的inter SSR区域的多个条带通过凝胶电泳得以分辨。
[0003]ISSR分子标记技术具有操作简单、快捷、DNA用量少、技术要求低、成本低等特点，引物设计无需知道基因组序列，只要目标区域的长度在可扩增范围内，就能扩增出微卫星重复问的DNA片段。因此，当前ISSR分子标记技术被广泛应用于遗传多样性的分析、遗传作图、系统进化及种质关系分析等领域。由加拿大哥化比亚大学(UBC)发布的一套通用ISSR
‑
PCR引物(http://www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers/Primers.pdf)，在品种资源研究中有较大的应用潜力，已经被广泛应用于不同物种的遗传多样性分析及种类的鉴别。韩睿等(2013)利用ISSR分子标记技术对3个菊芋品种进行鉴别；陈淑吟等(2008)对不同紫菜叶状体进行ISSR分子标记分析等。但是ISSR引物进行PCR的扩增产物稳定性易受到Taq酶、Mg
2+
、引物、退火温度、dNTP等条件的影响。模板DNA浓度与引物的退火(复性)温度也会影响到引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；而且，PCR反应的循环次数等也对结果产生影响。因此，要得到行之有效的PCR反应体系，必须通过进行大量的不同组合实验过程，最后才能得到有效的PCR反应体积及反应过程，用于进行不同种质的特异性分子量条带扩增与区分、鉴别。
[0004]黑鲷(Acanthopagrus schlegelii，AS)为鲷科(Sparidae)、棘鲷属(Acanthopagrus)中名贵经济鱼类。黑鲷广泛分布于日本、朝鲜及我国沿海，具有广温性、抗病力强及味道鲜美等特点，为我国沿海养殖的重要鱼类(Lee等，2001)。国内外学者Esselman等(1999)认为黑鲷是集约化养殖最有希望的对象之一。但，黑鲷的生长速度较慢制约了其养殖产业的发展；而同为鲷科的真鲷(Pagrus major)为赤鲷属(Pagrus)种类，其生长速度快且体色靓丽，也是我国沿海的重要养殖对象(江世贵等，2012)。为选育优良海水养殖新品种，本单位利用黑鲷与真鲷进行的多个杂交育种组合取得不少具有生长快、抗逆性强等目标性状优势的新种质，为海水鲷鱼养殖产业发展提供了多个优良新品系。利用育种研究培育出杂交后代中，以黑鲷、真鲷为亲本得到的杂交子代(黑鲷(
♀
)
×
真鲷(
♂
)杂交F1，HF1)及回交后代(黑鲷(
♀
)
×
杂交F1，BF1)等皆在江苏省海洋水产研究所养殖基地进行了养殖试验。但，HF1、BF1均与黑鲷的体形、外貌相似，从外观上无法进行区分，所以需要通过研究出简便易行的方法来辨别黑鲷与其杂交后代，以免产生种质混淆。除了重点关注杂交鱼的生长速度、抗逆性等经济性状，杂种子代个体的鉴别，也为育种研究的一个重要内容。至今尚未有关黑鲷、回交子代及杂交子代等种质鉴别相关检测方法的报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用ISSR引物鉴别黑鲷真鲷杂交子代的分子标记方法，该方法操作简便，费用低，准确度高且通用性好，能快速、有效地鉴别基于黑鲷真鲷亲本组合所得的杂交子代新品系，为基于黑鲷的新品种选育研究所得新种质的鉴别研究提供技术帮助。
[0006]本专利技术提供了一种利用ISSR引物鉴别黑鲷真鲷杂交子代的分子标记方法，包括：
[0007](1)分别提取黑鲷、回交及杂交子代等3个种质个体的总DNA，4℃以下保存备用；
[0008](2)采用UBC899引物作为ISSR引物对上述总DNA进行PCR扩增；其中，所述UBC899引物序列为：CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA；
[0009](3)凝胶电泳检测PCR产物的DNA条带情况，其中杂交子代无扩增带，黑鲷、回交子代在1000bp处有一条特异性条带。
[0010]所述步骤(2)中的PCR扩增反应体系为：引物0.5mmol/L，DNA模板约20ng，Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，Mg
2+
1.5μl，Taq聚合酶0.25μl，添加ddH2O至25μl。
[0011]所述步骤(2)中的PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，然后进入循环：94℃45s，52℃45s，72℃2min，共39个循环，最后一个循环结束后再在72℃继续延伸10min。
[0012]所述步骤(3)中的凝胶电泳检测条件为：制备1％琼脂糖凝胶后，吸取2
‑
4μl的PCR产物，加入0.8μl的溴酚蓝混匀，点入胶孔；另外，取2μl marker标准分子量(100～2000bp)点入另一胶孔，一起跑胶；电压为120V，电泳时间为20min后，通过凝胶成像系统，检测PCR产物的DNA条带情况。
[0013]在本实验的过程中，ISSR引物的扩增结果稳定性易受到Taq酶、Mg
2+
、引物、退火温度、dNTP等条件的影响，因此，为保证结果的清晰、可靠和准确，必须严格按照反应体系的模板浓度、退火温度及循环次数等要求进行。
[0014]本专利技术研究结果为黑鲷等种类的种质鉴别与利用研究提供了行之有效的简便操作方法。本专利技术所用到的扩增引物除可用现有技术中的黑鲷等鱼类，还可用于其它鲷科鱼类的遗传多样分析。
[0015]有益效果
[0016](1)本专利技术基于ISSR引物PCR反应体系得到了3个鲷鱼种质的特异性条带表达，拓宽了黑鲷及其杂交子代鉴别的技术体系，同时也为其它鲷科鱼类的种质鉴别提供了方法参考。
[0017](2)本专利技术无须进行引物的设计，无须采用特别的机体组织或其它特殊要求，只要是个体的未降解组织等均可，仅须按照设计好的程序进行PCR反应，就可准确、高效从这3个种类中进行对黑鲷真鲷杂交子代的种质鉴别。
[0018](3)本专利技术填补了应用ISSR分子标记方法区分鲷科中的黑鲷及其杂交子代的空白，最终绘制的区分试验所用多份样本材料的电泳模式图，可作为这3个不同种质材料区分出黑鲷真鲷杂交子代的依据。本专利技术摆脱了传统形态学鉴定的不可靠因素，确保黑鲷真鲷杂交子代种质在生产上的快速区分与应用。
附图说明
[0019]图1为本专利技术引物UBC899的鉴别结果图。
[0020]图2为引物UBC841的扩增结果图。
具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用ISSR引物鉴别黑鲷真鲷杂交子代的分子标记方法，包括：(1)分别提取黑鲷、回交及杂交子代3个种质个体的总DNA，4℃以下保存备用；(2)采用UBC899引物对上述总DNA进行PCR扩增；其中，所述UBC899引物序列为：CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA；(3)凝胶电泳检测PCR产物的DNA条带情况，其中杂交子代无扩增带，黑鲷、回交子代在1000bp处有一条明显条带分布。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增反应体系为：引物0.5mmol/L，DNA模板约20ng，Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，Mg
2+ 1.5μl，Taq聚合酶0.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈淑吟，张志勇，吉红九，贾超峰，孟乾，祝斐，徐大凤，张志伟，高波，孙瑞健，赵永超，汤小建，肖李霞，周亚文，
申请(专利权)人：江苏省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：