通过免疫标记建立植原体在介体和植株间循回传播的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过免疫标记建立植原体在介体和植株间循回传播的方法。所述植原体为小麦蓝矮病植原体，所述介体为异沙叶蝉；所述方法包括：在异沙叶蝉饲毒后不同时间，利用小麦蓝矮植原体表面免疫膜蛋白抗体免疫标记感染小麦蓝矮植原体的异沙叶蝉组织，观察不同时间段小麦蓝矮植原体在异沙叶蝉不同组织的分布，明确循回传播过程。本发明专利技术探明了小麦蓝矮植原体在介体异沙叶蝉体内循回传播途径，为后续研究病原与介体的互作奠定基础。后续研究病原与介体的互作奠定基础。后续研究病原与介体的互作奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
通过免疫标记建立植原体在介体和植株间循回传播的方法


[0001]本专利技术属于植物病理
，具体涉及通过免疫标记建立植原体在介体和植株间循回传播的方法。

技术介绍

[0002]植原体是一种依赖介体昆虫传播，专性寄生于植物韧皮部的单细胞原核生物，无细胞壁，隶属软壁菌门柔膜菌纲(Class Mollicutes,phylum Tenericutes)。通常发现一种新的植原体病害时，传播介体的鉴定主要针对患病植物附近发现的昆虫种类进行，常用方法是使用粘性诱捕、网扫等将其捕获，重点选取带有刺吸式口器的昆虫进行检测，确定其体内是否含有植原体。早期通过电镜观察昆虫介体中的植原体，后期随PCR技术发展，通过提取昆虫DNA确定带毒昆虫。
[0003]小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf disease，WBD)是我国小麦生产上重要病害之一。研究认为该病害主要发生在间作套种、麦草覆盖的旱塬地区和小麦灌溉区。小麦蓝矮病的广泛发生严重威胁我国小麦生产，是继黄矮病后又一个重要小麦病害，引起小麦矮缩、丛枝、不育等症状。近些年禾秆还田面积扩大，为传播介体繁衍生息提供有利农田小环境；全球温度升高，增加了传播介体活动周期，各项因素促使介体数量急剧上升，造成病害随介体迁飞广泛传播，导致周期性大爆发。传毒介体的的数量决定发病程度的高低，介体传毒成为病害流行的重要中心环节。
[0004]异沙叶蝉(Psammotettix alienusL.)是一种重要的传播介体，危害北方丘陵旱源地区小麦、大麦、燕麦等禾本科植物。其刺吸式口针可取食小麦植株的茎、叶维管束组织，使受害部位产生枯黄斑点，从而导致组织大面积失绿影响植物光合作用，阻碍植物生长发育。介体叶蝉能够传播病毒病、植原体等多种病害，目前研究较为深入的是小麦矮缩病(WDV)和小麦蓝矮病(WBD)，相关研究表明一旦传播介体大量繁殖，直接导致病害的大发生、大流行，严重影响小麦生产，威胁小麦粮食安全。
[0005]小麦蓝矮病由异沙叶蝉专化性传播，然而，小麦蓝矮病与介体异沙叶蝉互作机制并不清楚，研究者普遍认为带毒的亲代异沙叶蝉通过生殖系统将WBDp传递给子代异沙叶蝉。因此，小麦蓝矮植原体(Wheat blue dwarf phytoplasma，WBDp)的侵染循回过程，以及小麦蓝矮植原体经异沙叶蝉卵传问题，成为探明植原体与介体互作机制的关键。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于揭示出小麦蓝矮植原体(WBDp)在异沙叶蝉体内传播的途径，为后续研究病原与介体的互作奠定基础。
[0007]基于上述目的，本专利技术提供了一种通过免疫标记建立植原体在介体和植株间循回传播的方法。本专利技术所述方法涉及的植原体为小麦蓝矮病植原体，所述介体为异沙叶蝉。本专利技术的技术思路在于：在异沙叶蝉饲毒后不同时间，利用小麦蓝矮植原体表面免疫膜蛋白抗体免疫标记感染小麦蓝矮植原体的异沙叶蝉组织，观察不同时间段小麦蓝矮植原体在异
沙叶蝉不同组织的分布，明确循回传播过程。
[0008]进一步地，在通过免疫标记建立植原体在介体和植株间循回传播的方法中，经饥饿处理的异沙叶蝉转移至带有小麦蓝矮病植原体的小麦上饲毒，饲毒后解剖获取异沙叶蝉组织，所述组织为异沙叶蝉的消化道、生殖系统和唾液腺组织。
[0009]进一步地，在通过免疫标记建立植原体在介体和植株间循回传播的方法中，所述异沙叶蝉组织采用小麦蓝矮植原体表面免疫膜蛋白抗体与荧光素FITC的交联物标记。
[0010]WBDp不同时间在介体中的定位显示，通过免疫标记确定异沙叶蝉饲毒后不同时间小麦蓝矮植原体分布于异沙叶蝉的消化道和唾液腺组织。
[0011]基于本专利技术的技术思路，所述循回传播过程确定为：异沙叶蝉口针刺吸感染小麦蓝矮植原体的小麦维管束组织，小麦蓝矮植原体随食物通过异沙叶蝉口针进入异沙叶蝉的消化系统，通过滤室后到达中肠位置，侵染中肠上皮细胞进入肌肉层，释放到血腔最后到达唾液腺，再通过异沙叶蝉口针将小麦蓝矮植原体释放到新的小麦植株中，完成小麦蓝矮植原体的系统传播。
[0012]本专利技术应用免疫荧光标记技术，在饲毒后不同时期，利用表面免疫膜蛋白(Immunodominant membrane protein，IMP)抗体免疫标记感染WBDp的叶蝉消化系统和卵巢，观察不同时间段WBDp在叶蝉不同组织的分布，明确了侵染循回过程与卵传问题，为后续研究病原与介体的互作奠定基础。由此，本专利技术进一步请求保护所述方法在揭示小麦蓝矮植原体与异沙叶蝉互作方面的用途，以及所述方法在植原体病害防治方面的用途。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益效果或优点：
[0014]小麦蓝矮病是我国西北麦区一种重要植原体病害，引起小麦矮化、丛枝，由异沙叶蝉专化性传播，介体传毒成为病害流行的重要中心环节。植原体属于无细胞壁的原核生物，由一层膜包裹，因此其菌体表面免疫膜蛋白与媒介昆虫互作对传毒具有十分重要的意义。本专利技术创造性地利用IMP蛋白探究了小麦蓝矮植原体与介体异沙叶蝉的互作关系。
[0015]本专利技术揭示了小麦蓝矮植原体在介体异沙叶蝉体内循回传播途径。利用免疫荧光标记技术标记小麦蓝矮病植原体IMP(FITC标记IMP为绿色)和异沙叶蝉细胞骨架Actin(罗丹明标记鬼笔环肽为红色)，在饲毒后不同时间对WBDp在叶蝉体内不同位置定位，通过激光共聚焦显微镜首次观察到WBDp分布在介体中肠上皮细胞、肌肉层和唾液腺。首次明确WBDp在叶蝉体内循回传毒过程是异沙叶蝉口针刺吸毒源小麦维管束组织，WBDp随食物通过口针进入介体昆虫消化系统，通过滤室后到达中肠位置，侵染中肠上皮细胞进入肌肉层，释放到血腔最后到达唾液腺，通过口针取食将植原体释放到新的植株中，完成植原体的系统传播。
[0016]本专利技术通过对带毒叶蝉进行传毒实验，PCR检测亲代叶蝉雌虫、子代叶蝉成虫和饲喂小麦中的WBDp，免疫荧光标记亲代叶蝉雌虫卵巢和卵，表明带毒的亲代叶蝉无法通过生殖系统将WBDp传递给子代叶蝉，即WBDp不经叶蝉卵传递。可见，本专利技术也消除了众多研究者的技术偏见。
附图说明
[0017]图1为小麦蓝矮植原体的循回途径示意图。
[0018]图2为饲取WBDp异沙叶蝉的PCR检测图；M为DNA大小标记，1为健康叶蝉，2～11为饲毒叶蝉。
[0019]图3为异沙叶蝉传播WBDp引起小麦发病图；A为感病小麦(丛枝症状)，B为健康小麦，C为叶蝉群体饲毒，D为叶蝉取食带毒小麦。
[0020]图4为Rhodamine
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phalloidin和FITC
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IMP免疫标记图；A为Rhodamine
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phalloidin标记消化系统细胞骨架，B为Rhodamine
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phalloidin标记唾液腺细胞骨架，C为FITC
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IMP标记WBDp。
[0021]图5为异沙叶蝉解剖图；A为解剖叶蝉，B为异沙叶蝉成虫，C为Thermo Scientific Nunc细胞培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.通过免疫标记建立植原体在介体和植株间循回传播的方法，其特征在于，所述植原体为小麦蓝矮病植原体，所述介体为异沙叶蝉；所述方法包括：在异沙叶蝉饲毒后不同时间，利用小麦蓝矮植原体表面免疫膜蛋白抗体免疫标记感染小麦蓝矮植原体的异沙叶蝉组织，观察不同时间段小麦蓝矮植原体在异沙叶蝉不同组织的分布，明确循回传播过程。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：经饥饿处理的异沙叶蝉转移至带有小麦蓝矮病植原体的小麦上饲毒，饲毒后解剖获取异沙叶蝉组织，所述组织为异沙叶蝉的消化道、生殖系统和唾液腺组织。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述异沙叶蝉组织采用小麦蓝矮植原体表面免疫膜蛋白抗体与荧光素FITC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆文静，周通，吴云锋，周建朝，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：