一种测定培养基中磷酸根含量的方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种测定培养基中磷酸根含量的方法。本发明专利技术在缚酸剂吡啶作用下，将磷酸根和BSTFA(含1％TMCS)进行衍化反应，磷酸根中三个羟基中氢的位置的分别被三甲基硅取代，由原来分子量为95的磷酸根衍化形成了分子量为311.101的衍生物，形成了被气相

【技术实现步骤摘要】
一种测定培养基中磷酸根含量的方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种测定培养基中磷酸根含量的方法。

技术介绍

[0002]微藻作为低等植物，广泛分布于海洋、湖泊、陆地等地方。这些微藻有极高的固碳效率，为实现“碳达峰、碳中和”目标有极高的潜在的贡献价值。可溶性的磷有两种，一种是有机磷，另外一种是无机磷。大多数可溶性磷主要是磷酸根，只有少量磷酸氢根和磷酸二氢根。微藻只能利用可溶性的无机磷酸盐，称之为可溶性反应的磷酸盐。磷酸根浓度的多少将影响微藻的生长，因此能够准确定性和定量微藻培养基中的磷酸根变化对于微藻的生长尤为关键。而一般微藻会分泌一些代谢物到水体中，无法利用常规方法准确检测磷酸根的含量变化。
[0003]目前，国内外对磷酸根的测定方法有很多，归纳起来主要有以下几种：酸碱滴定法、比色法。1)酸碱滴定法即用加入盐酸煮沸，使焦磷酸盐全部转化为磷酸，用EDTA掩蔽Cu，然后以甲基橙指示，用氢氧化钠中和剩余的酸。再以酚酞指示，用氢氧化钠滴定磷酸二氢根成磷酸氢根。2)比色法：在硫酸介质中，以抗坏血酸做还原剂，硝酸铋做催化剂，使磷酸与钼酸钠生成杂多酸蓝色络合物，在pH＝4的条件下，用乙酸锌使焦磷酸盐沉淀去除其干扰，铜离子的影响用等量的空白液消除。在波长660nm处测定吸光度。3)钼酸铵分光度法的原理为在酸性溶液中磷酸根盐与钼酸反应生成黄色的磷钼杂多酸，再用抗坏血酸将磷钼杂多酸还原成磷钼蓝，在710nm最大吸收波长处用分光光度法测定。但是这些方法依然存在耗时长，操作繁琐，灵敏度低，干扰多以及不能同时定性等缺陷。因此，本专利技术基于气相
‑
质谱联用检测的基础上开发一种操作时间短、灵敏度高、准确定性和定量的检测磷酸根的方法。为各个领域科学研究及应用，尤其是微藻在水产动物养殖废水培养中提供一种检测磷酸根盐的技术支持。
[0004]然而，以上方法依然存在耗时长，操作繁琐，灵敏度低，干扰多以及不能同时定量、定性等缺陷。因此，本专利技术基于气相
‑
质谱联用检测的基础上开发一种操作时间短、干扰少、灵敏度高和定量的检测磷酸根的方法，为各个领域科学研究及应用，尤其是微藻培养提供一种检测磷酸根浓度的技术支持。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种测定培养基中磷酸根的方法，该方法可定量检测磷酸根，具有操作时间短、灵敏度高、准确性高的特点。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]一种测定培养基中磷酸根含量的方法，包括以下步骤：
[0008]1)取待测培养基样本，经膜过滤、氦气吹干后，依次加入吡啶、含甲基三氯硅烷的N，O
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双(三甲基硅烷基)三氟乙酸溶液，震荡后水浴，获得含式I化合物的待测液；
[0009]2)利用气相
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质谱法检测所述待测液中式I化合物的浓度，计算培养基中磷酸根的
含量；
[0010][0011]一些实施方案中，所述培养基为微藻培养基，可以是未进行培养的培养基，也可以是培养过微藻的培养基；所述微藻包括裸藻和/或小球藻，包括但不仅限于此。
[0012]一些实施方案中，步骤1)中所述吡啶和含甲基三氯硅烷的N，O
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双(三甲基硅烷基)三氟乙酸溶液的体积比为4:1。
[0013]一些实施方案中，步骤1)中所述震荡的时间为30秒。
[0014]一些实施方案中，步骤1)中所述水浴为50℃水浴5min。
[0015]一些实施方案中，步骤1)中所述膜过滤的滤膜孔径为0.22μm。
[0016]一些实施方案中，步骤1)中所述含甲基三氯硅烷的N，O
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双(三甲基硅烷基)三氟乙酸溶液中甲基三氯硅烷的质量分数为1％。
[0017]一些实施方案中，所述气相
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质谱检测的条件为：
[0018]气相
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质谱的进样口、四级杆、离子源、传输线温度分别为150℃、150℃、280℃、320℃；
[0019]升温程序为：温度60℃维持1
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3分钟，升温到180℃维持1
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3分钟，总共运行12
‑
15分钟；
[0020]分流比为100:1；
[0021]进样体积为1μl；
[0022]纯氦气流速为1.2mL/min；
[0023]设置扫描模式，50
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500m/z。
[0024]本专利技术所述步骤2)之前还包括：制备梯度浓度的标准品液，对所述标准溶液采用气相
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质谱检测，以峰面积为纵坐标，磷酸根浓度为横坐标，标建立标准曲线。
[0025]一些实施方案中所述梯度浓度的标准品溶液由水和磷酸氢钾组成，磷酸根的浓度为0.05～1mg/ml；优选地，所述磷酸根的浓度具体为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml和0.05mg/ml。
[0026]本专利技术在缚酸剂吡啶作用下，将磷酸根和BSTFA(含1％TMCS)进行衍化反应，磷酸根中原来三个氢的位置分别被三甲基硅取代，由原来分子量为95的磷酸根衍化形成了分子量为311.101的衍生物，形成了被气相
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质谱检测到的质谱图，根据该质谱图可对培养基中的磷酸根进行定性分析，根据标准品浓度曲线和气相质谱检测结果可对培养基中的磷酸根进行定量分析，且操作时间短、灵敏度高。
附图说明
[0027]图1示本专利技术检测原理以及磷酸根衍生物的质谱图；
[0028]图2示标准样品衍生化后的保留时间；
[0029]图3为微藻培养基中磷酸根衍生物的出峰时间；
[0030]图4为根据标准样品的浓度梯度以及峰面积建立的标准曲线以及R相关系数；
[0031]图5为根据标准曲线和样品的峰面积计算出微藻培养基中磷酸根的浓度。
具体实施方式
[0032]本专利技术提供了一种测定培养基中磷酸根含量的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。
[0033]本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0034]下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：
[0035]实施例1
[0036](一)制样
[0037]1.用盐酸调培养基pH低于2，再用0.22μm膜过滤1mL微藻培养基，取100μl微藻培养基转移到安捷伦小瓶子中；
[0038]2.利用普通氦气对上清液吹干，大概20分钟；
[0039]3.在已经氮吹干的瓶子里加入400μl吡啶，再加入100μlN,O
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双(三甲基硅烷基)三氟乙酸(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定培养基中磷酸根含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取待测培养基样本，经膜过滤、氦气吹干后，依次加入吡啶、含甲基三氯硅烷的N，O
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双(三甲基硅烷基)三氟乙酸溶液，震荡后水浴，获得含式I化合物的待测液；2)利用气相
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质谱法检测所述待测液中式I化合物的浓度，计算培养基中磷酸根的含量；2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基为微藻培养基；所述微藻包括裸藻和小球藻。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述吡啶和含甲基三氯硅烷的N，O
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双(三甲基硅烷基)三氟乙酸溶液的体积比为4:1。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述震荡的时间为30秒。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述水浴为50℃水浴5min。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述膜过滤的滤膜孔径为0.22μm。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述含甲基三氯硅烷的N，O
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【专利技术属性】
技术研发人员：路延笃，吴明灿，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：