一种鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器及其制备方法，旨在提供一种能够对ppGpp进行生物检测的传感器及制备方法。该传感器在基底上通过桥联剂壳聚糖吸附纳米金颗粒及鸟苷四磷酸水解酶MESH1分子，并通过封闭液封闭，使得基底上形成壳聚糖膜层、纳米金溶胶层、MESH1酶层及封闭层。该制备方法包括：在预处理的电极上加低浓度的壳聚糖溶液，干燥后，在电极表面形成壳聚糖膜；将带有壳聚糖膜的电极晾干并置于纳米金溶胶中，在4℃下自组装至少12h；用超纯水冲洗并晾干，在MESH1酶蛋白溶液中于4℃自组装至少12h；清洗后使用封闭液封闭非特异性位点；清洗晾干得到传感器。该传感器灵敏度高、特异性强，快速定量，响应时间短。短。短。

【技术实现步骤摘要】
一种鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，更具体的说，是涉及一种鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器及其制备方法、该鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器的应用，以及利用所得的鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器进行鸟苷四磷酸生物检测的方法。

技术介绍

[0002]鸟苷四磷酸(ppGpp)是生物体内传递氮饥饿信号的一种重要化合物，在生物生长及生存中起着至关重要的作用。目前已知的ppGpp检测方法包括：基于液相色谱
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质谱技术(UPLC
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MS)和化学荧光探针技术。液相色谱
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质谱技术检测灵敏度高、准确性好，但需要依赖于昂贵的仪器设备和专业测试人员，且分析时间相对较长。化学荧光探针技术具有极高的检测灵敏度，但传感器制备复杂，而且，具有不稳定性。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种能够对ppGpp进行生物检测的电化学型纳米酶传感器。
[0004]本专利技术的另一个目的是提供一种制备方法简单，灵敏度高、特异性强、快速定量的ppGpp电化学型纳米酶传感器的制备方法。
[0005]本专利技术的再一个目的是提供一种鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器在检测ppGpp方面的应用。
[0006]本专利技术的再一个目的是提供一种灵敏度高、特异性强、快速定量的ppGpp的生物检测方法。
[0007]为实现本专利技术的目的所采用的技术方案是：
[0008]一种鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器，以电极为基底，在所述基底上通过桥联剂壳聚糖吸附纳米金颗粒及鸟苷四磷酸水解酶MESH1分子，并通过封闭液封闭，使得所述基底上形成壳聚糖膜层、纳米金溶胶层、MESH1酶层及封闭层，所述封闭液为牛血清蛋白。
[0009]一种鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器的制备方法，包括下述步骤：
[0010](1)在预处理的电极上加低浓度的壳聚糖溶液，干燥后，在所述电极表面形成壳聚糖膜；之后，使用低浓度NaOH溶液消除所述壳聚糖膜中所含的酸根；
[0011](2)将带有壳聚糖膜的电极晾干并置于纳米金溶胶中，在4℃下自组装至少12h；
[0012](3)将步骤(2)所得电极取出，用超纯水冲洗并晾干，然后在鸟苷四磷酸水解酶MESH1酶蛋白溶液中于4℃自组装至少12h；所述MESH1酶蛋白溶液的浓度不低于0.5mg/mL。
[0013](4)将步骤(3)所得电极取出，清洗后使用封闭液封闭非特异性位点；
[0014](5)将步骤(4)所得电极清洗晾干，得到鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器。
[0015]所述电极为玻碳电极，所述玻碳电极的预处理方法为：将玻碳电极用0.03μm粒径的氧化铝浆在麂皮上呈8字形抛光，用水清洗后在超声水浴中清洗至表面光滑洁净；所述电极预处理后满足如下要求：在处理液中的循环伏安曲线的峰电位差为64
‑
80mV，所述处理液
采用浓度为1mmol/L的K3Fe(CN)6溶液，所述K3Fe(CN)6溶液中含浓度为0.20mol/L的KNO3；所述循环伏安曲线的扫描范围为0.6～－0.1V，扫描速度为50mV/s。
[0016]步骤(1)中，所用壳聚糖溶液的浓度为0.5％；所用NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，浸入NaOH溶液的时间为5分钟。
[0017]步骤(2)所述纳米金溶胶通过下述方法制得：将1％的柠檬酸钠溶液与浓度为0.01％的氯金酸溶液按照1：25的比例混合，使用中火功率的微波保持5
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10min至反应溶液成鲜红色；所述纳米金溶胶中的纳米金呈球形，颗粒分散均匀，粒径为20
±
2nm。
[0018]所述封闭液采用浓度为5％的牛血清白蛋白溶液，封闭条件为于37℃孵育至少1h。
[0019]一种鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器的应用，用于检测ppGpp的含量。
[0020]一种鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器进行鸟苷四磷酸的生物检测方法，，包括下述步骤：
[0021](1)建立三电极系统：将所述鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极；采用超纯水作为空白对照；
[0022](2)采用上述三电极系统通过时间
‑
电流法测定不同浓度的ppGpp标准品在优化电压作用下的响应电流，利用公式(1)得到ppGpp响应电流变化率，并建立ppGpp响应电流变化率与ppGpp浓度关系曲线；通过所述ppGpp响应电流变化率与ppGpp浓度曲线来确定线性浓度范围；根据ppGpp响应电流变化率与ppGpp浓度的线性关系，拟合线性方程；
[0023][0024]式(1)中：ΔI表示响应电流的变化率；I1表示空白对照的响应电流值，单位：A，I2表示ppGpp溶液的响应电流值，单位：A；
[0025](3)采用上述三电极系统对待测样品进行测定，并运用所得线性方程对待测样品中的ppGpp进行检测，得到待测样品中ppGpp的含量。
[0026]检测前对待测样品进行预处理：向待检测样品溶液添加NADP磷酸酶以避免NADPH或NADP
+
干扰。
[0027]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0028]1、本专利技术的鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器能够对ppGpp进行生物检测，而且，检测灵敏度高、特异性强，稳定性好，快速定量，响应时间短。
[0029]2、本专利技术的鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器的制备方法简单，所得传感器检测灵敏度高、特异性强，快速定量，响应时间短。
[0030]3、本专利技术的检测方法为生物检测方法，该方法采用灵敏度高、特异性强的生物传感器进行检测，无需对样品进行复杂预处理，操作简单，不依赖昂贵的仪器设备，响应时间短，稳定性好，能够特异性测定ppGpp，对于研究动物、植物以及微生物氨基酸或核苷酸饥饿以及严谨反应的信号传递机理具有非常重要意义和应用前景。
附图说明
[0031]图1所示为本专利技术的生物检测方法原理图；
[0032]图2所示为测定ppGpp的传感器响应电流与浓度的相关性曲线；
[0033]图3所示为ppGpp、GTP、GMP、ADP和ATP的响应电流变化率与浓度的相关性曲线。
具体实施方式
[0034]以下结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。
[0035]实施例1
[0036]1、玻碳电极的预处理：
[0037]将玻碳电极用0.03μm粒径的氧化铝浆在麂皮上呈8字形抛光，用水清洗后在超声水浴中清洗数十秒，至表面光滑洁净；该电极在1
×
10
‑3mol/L K3Fe(CN)6溶液(含0.20mol/L KNO3)中用扫描范围为0.6～－0.1V，扫描速度为50mV/s的循环伏安法活化电极，重复扫描直至出现稳定的循环伏安曲线。上述稳定的循环伏安曲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器，其特征在于，以电极为基底，在所述基底上通过桥联剂壳聚糖吸附纳米金颗粒及鸟苷四磷酸水解酶MESH1分子，并通过封闭液封闭，使得所述基底上形成壳聚糖膜层、纳米金溶胶层、MESH1酶层及封闭层，所述封闭液为牛血清蛋白。2.一种权利要求1所述的鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)在预处理的电极上加低浓度的壳聚糖溶液，干燥后，在所述电极表面形成壳聚糖膜；之后，使用低浓度NaOH溶液消除所述壳聚糖膜中所含的酸根；(2)将带有壳聚糖膜的电极晾干并置于纳米金溶胶中，在4℃下自组装至少12h；(3)将步骤(2)所得电极取出，用超纯水冲洗并晾干，然后在鸟苷四磷酸水解酶MESH1酶蛋白溶液中于4℃自组装至少12h；所述MESH1酶蛋白溶液的浓度不低于0.5mg/mL。(4)将步骤(3)所得电极取出，清洗后使用封闭液封闭非特异性位点；(5)将步骤(4)所得电极清洗晾干，得到鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器。3.根据权利要求2所述的鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器的制备方法，其特征在于，所述电极为玻碳电极，所述玻碳电极的预处理方法为：将玻碳电极用0.03μm粒径的氧化铝浆在麂皮上呈8字形抛光，用水清洗后在超声水浴中清洗至表面光滑洁净；所述电极预处理后满足如下要求：在处理液中的循环伏安曲线的峰电位差为64
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80mV，所述处理液采用浓度为1mmol/L的K3Fe(CN)6溶液，所述K3Fe(CN)6溶液中含浓度为0.20mol/L的KNO3；所述循环伏安曲线的扫描范围为0.6～－0.1V，扫描速度为50mV/s。4.根据权利要求2所述的鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所用壳聚糖溶液的浓度为0.5％；所用NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，浸入NaOH溶液的时间为5分钟。5.根据权利要求2所述的鸟苷四磷酸电化学型纳米酶传感器的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁丁强，庞广昌，任瑞娟，裴陈琳，刘丹阳，冯春雷，王轼，
申请(专利权)人：天津商业大学，
类型：发明
国别省市：