一种将植物基因组中的碱基C突变为碱基T的方法技术

本发明专利技术公开了一种将植物基因组中的碱基C突变为碱基T的方法。本发明专利技术方法包括如下步骤：将SpRYn、胞嘧啶脱氨酶、sgRNA和UGI导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T。通过实验证明：本发明专利技术方法可对位于植物基因组上的PAM序列为NGN的靶点序列中的碱基C进行编辑，实现碱基C到碱基T的替换，在拓展可编辑的C的范围的同时，还提高了碱基替换效率。还提高了碱基替换效率。

【技术实现步骤摘要】
一种将植物基因组中的碱基C突变为碱基T的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种将植物基因组中的碱基C突变为碱基T的方法。

技术介绍

[0002]CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9 protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。
[0003]2016年，David Liu和Akihiko Kondo两个实验室分别独立报道了两种不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，CBE)，分别使用了两种不同的胞苷脱氨酶rAPOBEC1(rat APOBEC1)和PmCDA1(activation-induced cytidine deaminase(AID)ortholog from sea lamprey)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶直接实现对单个胞嘧啶(Cytosine，C)碱基进行编辑，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了C替换为胸腺嘧啶(Thymine，T)的碱基编辑效率。具体为dead Cas9(dCas9)或the Cas9 nickase(Cas9n)连带着rAPOBEC1或PmCDA1通过向导RNA定位到靶点，rAPOBEC1或PmCDA1催化非配对的单链DNA上的C发生胞嘧啶脱氨反应变成尿嘧啶(Uracil，U)，通过DNA的修复使得U与腺嘌呤(Adenine，A)配对，又通过DNA复制，最终使得T与A配对，从而实现了C到T的转换。在所测试的编辑器中，SpCas9n(D10A)&rAPOBEC1/PmCDA1&UGI碱基编辑系统(其含有尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI)的平均突变率较高，原因有二：一是UGI可以抑制尿嘧啶DNA糖化酶(uracil DNA glycosylase，UDG)催化清除DNA中U，二是SpCas9n(D10A)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patch BER(base-excision repair)修复机制，促使U:G错配更多的偏好性修复成U:A。
[0004]目前，SpCas9n(D10A)&rAPOBEC1/PmCDA1&UGI碱基编辑系统已被广泛应用到水稻中，实现C到T的转换，但编辑的靶点主要局限在PAM(Protospacer Adjacent Motif)为NGG的序列，大大限制了可编辑的C的范围。SpCas9的变体SpCas9-NG能够识别NGN(N＝A，T，C或G)PAM靶点，被成功的开发成CBE(SpCas9-NG-CBE)，大大拓展了动物和植物基因组中可编辑的C的范围，但是相对于NGA，NGT和NGG PAM靶点，SpCas9-NG-CBE对NGC PAM靶点的编辑能力低。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法。
[0006]本专利技术提供的将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法为如下1)或2)或3)或
4)：
[0007]所述1)包括如下步骤：将SpRYn、胞嘧啶脱氨酶、sgRNA和UGI导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；
[0008]所述2)包括如下步骤：将SpRYn、胞嘧啶脱氨酶和sgRNA导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；
[0009]所述3)包括如下步骤：将SpRYn的编码基因、胞嘧啶脱氨酶的编码基因、转录sgRNA的DNA分子和UGI的编码基因导入植物体内，使所述SpRYn、所述胞嘧啶脱氨酶、所述sgRNA和所述UGI均得到表达，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；
[0010]所述4)包括如下步骤：将SpRYn的编码基因、胞嘧啶脱氨酶的编码基因和转录sgRNA的DNA分子导入植物体内，使所述SpRYn、所述胞嘧啶脱氨酶和所述sgRNA均得到表达，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；
[0011]所述sgRNA靶向靶点序列；
[0012]所述靶点序列的PAM序列为NGN；N为A、T、C或G。
[0013]上述将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法中，所述sgRNA为tRNA-esgRNA；
[0014]所述tRNA-esgRNA如式I所示：tRNA-所述靶点序列转录的RNA-esgRNA骨架(式I)；
[0015]所述tRNA为m1)或m2)或m3)：
[0016]m1)将序列1第597-673位中的T替换为U得到的RNA分子；
[0017]m2)将m1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
[0018]m3)与m1)或m2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；
[0019]所述esgRNA骨架为n1)或n2)或n3)：
[0020]n1)将序列1第694-779位中的T替换为U得到的RNA分子；
[0021]n2)将n1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
[0022]n3)与n1)或n2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。
[0023]上述将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法中，所述SpRYn为A1)或A2)或A3)：
[0024]A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
[0025]A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0026]A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0027]所述胞嘧啶脱氨酶可为human APOBEC3A、human AID、PmCDA1或rAPOBEC1等蛋白质。在本专利技术的具体实施例中，所述胞嘧啶脱氨酶为PmCDA1。
[0028]所述PmCDA1为C1)或C2)或C3)：
[0029]C1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
[0030]C2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法，为如下1)或2)或3)或4)：所述1)包括如下步骤：将SpRYn、胞嘧啶脱氨酶、sgRNA和UGI导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；所述2)包括如下步骤：将SpRYn、胞嘧啶脱氨酶和sgRNA导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；所述3)包括如下步骤：将SpRYn的编码基因、胞嘧啶脱氨酶的编码基因、转录sgRNA的DNA分子和UGI的编码基因导入植物体内，使所述SpRYn、所述胞嘧啶脱氨酶、所述sgRNA和所述UGI均得到表达，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；所述4)包括如下步骤：将SpRYn的编码基因、胞嘧啶脱氨酶的编码基因和转录sgRNA的DNA分子导入植物体内，使所述SpRYn、所述胞嘧啶脱氨酶和所述sgRNA均得到表达，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；所述sgRNA靶向靶点序列；所述靶点序列的PAM序列为NGN；N为A、T、C或G。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SpRYn为A1)或A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述胞嘧啶脱氨酶为PmCDA1；所述PmCDA1为C1)或C2)或C3)：C1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；C2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；C3)在C1)或C2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述UGI为E1)或E2)或E3)：E1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；E2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述sgRNA为tRNA-esgRNA；所述tRNA-esgRNA如式I所示：tRNA-所述靶点序列转录的RNA-esgRNA骨架(式I)；所述tRNA为m1)或m2)或m3)：m1)将序列1第597-673位中的T替换为U得到的RNA分子；m2)将m1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；m3)与m1)或m2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；所述esgRNA骨架为n1)或n2)或n3)：n1)将序列1第694-779位中的T替换为U得到的RNA分子；
n2)将n1)所示的RNA分子经过一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王飞鹏，赵思，刘亚，宋金岭，贺晓庆，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：