本发明专利技术公开了一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法，包括：(1)石油降解菌的筛选、富集与培养，其中以苯作为诱导和筛选条件；(2)混合培养细菌多样性分析；(3)混合细菌石油污染物降解能力测定；(4)混合细菌对土壤石油污染物降解效果的确定以及最优化降解体系构建；(5)土壤宏基因组学测序及其数据分析；(6)土壤宏基因组学分析关键降解酶丰度组间差异性；(7)氢供体降解系统构建方法。本发明专利技术在常温及低温条件下通过原位土著细菌实现的石油烃降解，即苯诱导混合细菌优化降解和氢供体降解。氢供体降解可以持续进行，并缓慢恢复土壤的微生态环境；修复土壤生态过程中无二次污染。二次污染。二次污染。
【技术实现步骤摘要】
一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法
[0001]本专利技术属于环境污染物微生物学技术处理和修复领域，具体地说，涉及一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法。本专利技术的主要微生物群体属于细菌，而且是兼性营养型细菌，既可以利用现成的有机物，又可以利用石油烃类有机物，并且能够耐受石油烃等有毒物质的胁迫。
技术介绍
[0002]石油是现代社会最重要的化石能源之一，由于现代全球工业化的迅速发展，被人类称为“工业血液”的石油的需求突飞猛进。随着开采、运输、精炼和利用，导致大量石油泄漏到环境中，造成经济损失和资源浪费。在自然界里，存在几百或者上千种微生物可以降解石油。微生物之所以能够降解石油烃是因为微生物的群落与物种的组成。有文章报道，菌群在石油污染的环境里，可以降解与利用烃类化合物的微生物，其数量将快速增加。Atlas报告说，一般的情况时，石油烃降解菌通常仅是微生物群落的1％。在存在石油污染的情况下，则能够有效的提升降解菌数量，使其占比达到10％。所以受到石油污染时，降解石油微生物种群将会出现明显的变化，有逐步扩展的趋势，导致石油污染区降解菌的数量大幅度增加。而降解菌的数量和污染程度之间表现为正相关性，即在石油污染更严重时，则往往会形成数量更大的石油降解菌。如今，国内外有许多关于单一的菌种对油污土壤进行生物降解的报道，在应用中不容易实现较好的降解效果。
技术实现思路
[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供了一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法，利用苯诱导富集，获得了具有丰富单加氧酶以及双加氧酶的纯培养和混合微生物，对石油烃进行全面的降解，通过测定降解率确定纯培养以及混合微生物的降解作用优势。同时利用Illumina Hiseq平台的宏基因组测序方法分析污染土壤的微生物群落演替特征，能够更加有效地识别参与的微生物类群、种类，分析降解的规律。创新性地提出继续采用氢供体降解的方法，完成石油烃的持续降解。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0005]一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法，其技术构思如下：
[0006]以阜新DL油库石油污染土壤为土著微生物来源，采用苯连续诱导培养，获得土著兼性营养型混合微生物，用这些原位混合微生物降解其所在土壤环境的石油污染物。用重量法与气相色谱质谱(GC
‑
MS)法结合测定石油烃含量并确定降解率。土壤的修复前后pH、有机质、有效磷和阳离子交换率等测定并记录。与此土著微生物降解过程并行的是利用土壤环境宏基因组学方法，分析60天时间里的对照组、纯培养降解组和混合微生物降解组的组间代谢差异基因丰度变化情况，根据主要氧化酶基因丰度的变化规律确定了后续的氢供体降解系统的必要性。氢供体降解系统完成了混合细菌降解的未尽之能。
[0007]具体按照以下工艺步骤进行：
[0008](1)兼性营养型土著混合微生物的获得。DL油库(E121.5544,N41.9095)附近石油污染土壤降解菌的筛选、富集培养。培养采用改良的基础盐培养基(MSM)，其组成如下所示：改良的基础盐培养基(MSM)：(NH4)2SO
4 2.0～3.0g/L；MgSO4·
7H2O 0.2～0.3g/L；CaCl2·
2H2O 0.01～0.5g/L；FeSO4·
7H2O 0.001～0.01/L；Na2HPO4·
12H2O 1.5～2.0g/L；KH2PO
4 1.5～2.0g/L；蒸馏水1000ml；另外需要加入葡萄糖0.5～2.0g/L、胰蛋白胨0.5～3.0g/L。121℃灭菌20～40分钟。苯作为降解性微生物的诱导剂，需要0.22μm孔径的滤膜过滤除菌后加入培养基中，并调整终浓度至150～200mg/L。基于相同的方式再将菌液3次转接富集培养。
[0009](2)混合培养细菌群落结构多样性的识别。步骤(1)中培养所得的细菌群落通过16S rRNA基因作为群落结构识别的靶位点。其微生物群落组成丰度分别为肠球菌属(Enterococcus)79％
±
3％、不动杆菌属(Acinetobacter)15％
±
3％、芽孢杆菌属(Bacillus)3％
±
3％、克雷伯氏菌属(Klebsiella)2％等，其成员类型以兼性营养型为主。
[0010](3)生化降解能力测定实验：用纯菌(不动杆菌)和混合菌对阜新DL油库的石油进行降解实验，利用分光光度计和气相色谱
‑
质谱法(GC/MS)联合对降解前后的石油进行组分变化分析，主要分析石油组分里的正构烷烃、多环芳烃以及总石油烃含量。
[0011](4)最优化石油污染土壤的降解体系的构建。根据单因素优化结果构建的降解系统组成成分有以下各项：取100g土(土壤石油浓度100g/kg)，接种量10％～20％(V/W)，即10～20mL菌液(浓度大约在1
×
10
7～8
个/mL)；pH为6.5～7.5；牛肉膏用量0.4～0.6％(W/W)。
[0012]实验室自然条件下60天结束降解，在此期间，每天浇水20～30mL保持土壤含水量在20％～30％的湿润条件，有利于细菌生理生化反应的顺利进行以完成降解。
[0013](5)降解前后土壤的宏基因组序列存在特征性。宏基因组学原始序列提交至NCBI数据库，检索号为SRX13239659、SRX13239660、SRX13239661、SRX13239662、SRX13239663、SRX13239664、SRX13239665、SRX13239666和SRX13239667。
[0014](6)土壤宏基因组学测序及其数据分析。土壤宏基因组学分析发现对照组、单菌降解组和混菌降解组存在关键降解酶基因丰度差异，这种差异表现在代谢基因丰度有明显变化。即随着污染物的浓度降低，对照组、单菌降解组和混菌降解组的加氧酶丰度依次降低；而与此相反的是脱氢酶丰度依次升高。依此理论提出构建氢供体降解系统以完成后续石油烃降解。
[0015](7)土壤石油烃氢供体降解系统的构建。混合细菌降解结束后立刻构建氢供体降解系统。方法如下：用植物粉碎机将无氧堆肥松针土磨碎成20目的粉末。松针土的有机碳和有机质经测定分别为21.95g/kg和37.83g/kg。称取磨碎的松针土10～20g与100g土壤充分混匀。每天加入20～30mL水并搅拌均匀以保持原有微生物活性，确保脱氢酶继续发挥氧化作用。
[0016]优选的，所述的步骤(2)和(4)的苯诱导下的土著原位微生物群落结构的利用；还包括步骤(6)所述的土著微生物群落中氧化酶丰度变化分析方法，并根据氧化酶基因丰度分析结果构建了步骤(6)中所述的石油污染物持续降解系统。
[0017]由上，本专利技术的特殊之处在于让降解性微生物持续发挥作用，直至石油污染物无害降解并矿。本专利技术从阜新DL油库周边(E121.5544,N41.9本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于宏基因组学的土著细菌修复石油污染土壤的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)DL油库附近石油污染土壤降解菌的筛选、富集培养：培养采用改良的基础盐培养基，其组成如下：(NH4)2SO
4 2.0～3.0g/L；MgSO4·
7H2O 0.2～0.3g/L；CaCl 2
·
2H2O 0.01～0.5g/L；FeSO4·
7H2O 0.001～0.01/L；Na2HPO4·
12H2O 1.5～2.0g/L；KH2PO
4 1.5～2.0g/L；蒸馏水1000ml；另外需要加入葡萄糖0.5～2.0g/L、胰蛋白胨0.5～3.0g/L；121℃灭菌20～40分钟；苯作为降解性微生物的诱导剂，需要0.22μm孔径的滤膜过滤除菌后加入培养基中，并调整终浓度至150～200mg/L；基于相同的方式再将菌液3次转接富集培养；(2)混合培养细菌群落结构多样性的识别：步骤(1)中培养所得的细菌群落通过16S rRNA基因作为群落结构识别的靶位点，其微生物群落组成丰度分别为肠球菌属79％
±
3％、不动杆菌属15％
±
3％、芽孢杆菌属3％
±
3％、克雷伯氏菌属2％等，其成员类型以兼性营养型为主；(3)生化降解能力测定实验：用纯菌和混合菌对DL油库的石油进行降解实验，利用分光光度计和气相色谱
‑
质谱法联合对降解前后的石油进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱宏飞，沙赫，华铮，
申请(专利权)人：辽宁工程技术大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。