一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法技术

本发明专利技术公开了一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法，该方法别对待测物体拍摄环形照明和非相干科勒照明下的两张强度图，将两张图像通过空域分割，频域加权两个步骤进行融合。相比传统非相干照明，具有更高的成像分辨率和更好的成像效果；相比将聚光镜照明数值孔径开到最大时的科勒照明，具有更大的成像景深。深。深。

【技术实现步骤摘要】
一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法


[0001]本专利技术涉及光学显微成像技术，具体涉及一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法。

技术介绍

[0002]在照明光一定的情况下，显微镜的光学分辨率由物镜的数值孔径决定，所以要想对物体看的越精细，就需要越大数值孔径的物镜。然而瑞利判据下的光学分辨率截止频率只是人眼直接观察的分辨率极限，并不是光学成像系统的理论分辨率极限。光学系统的理论分辨率极限f(Katsumasa Fujita,Follow
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up review:recent progress in the development of super
‑
resolution optical microscopy[J],Microscopy,Volume 65,Issue 4,August 2016,275
–
281)为：
[0003][0004]其中，NA
ill
为照明光源的数值孔径，当物镜数值孔径NA
obj
较小时，NA
ill
通常与NA
obj
相等，此时光学系统的理论分辨率极限f为：
[0005][0006]但是光学成像系统往往并不能达到其理论分辨率极限，原因是光学成像系统对信息的传递能力随着频率的升高而衰减，到截止频率附近衰减到0，会导致一定范围内的高频信息被淹没在噪声中。所以光学成像系统的分辨率难以达到理论分辨率极限的问题亟待解决。
[0007]另一方面，使用高数值孔径NA的物镜尽管能提升成像系统的光学分辨率，但是会带来另一个问题：成像系统的景深被缩小了，这对于观察具有一定厚度的待测样品是相当不利的。这是因为大角度的照明光会将离焦面的相位信息也传递到成像面，造成离焦的效果(Chao Zuo,Transport of intensity equation:a tutorial[J],Optics and Lasers in Engineering,Volume 135,2020,106
‑
187)。这时往往需要通过减小聚光镜的照明数值孔径NA来提高成像景深，但这样又会导致成像分辨率的降低。所以对于具有厚度的样品而言，成像分辨率和成像景深是不可兼得的。

技术实现思路

[0008]本专利技术公开了一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法，用于解决传统科勒照明下，成像景深与分辨率无法兼顾的问题。
[0009]本专利技术的技术方案如下：一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法，步骤如下：
[0010]步骤一.采集原始图像，分别对待测样品使用环形照明和科勒照明，拍摄两种照明模式下的光强图I
Kohler
,I
annular
，以及不放置待测样品时的两张背景光强图I
B_Kohler
,
I
B_annular
；
[0011]步骤二.对原始图像进行预处理，根据背景光强图I
B_Kohler
,I
B_annular
对I
Kohler
,I
annular
进行光强归一化处理得到I'
Kohler
,I'
annular
；
[0012]步骤三.对I'
annular
进行空域分割，得到I”annular
；
[0013]步骤四.对I'
Kohler
,I”annular
两张光强图进行频域加权相加融合，得到融合后的光强图I
fusion
；
[0014]步骤五.对融合后的光强图I
fusion
进行反卷积得到I
deconv
。
[0015]优选的，步骤一中，环形照明所使用的照明环外径为R，内径为r，照明环外径照明数值孔径为内径照明数值孔径为显微物镜的数值孔径为NA
obj
，照明光源距离待测样品的高度为h，且必须满足NA
R
＝NA
obj
，内径照明数值孔径NA
r
的典型范围为(0.9NA
R
,NA
R
)。
[0016]优选的，步骤二中，对光强图I
Kohler
,I
annular
的亮度进行归一化的公式为：
[0017][0018][0019]其中，I'
Kohler
,I'
annular
是处理后的光强图，mean()是对括号内图像求取平均值，a为图像亮度控制系数，典型范围为(0.7,0.9)。
[0020]优选的，步骤三具体为：
[0021]首先，求取I'
Kohler
,I'
annular
灰度值分布差异的特性图I
difference
，I
difference
＝|I'
Kohler
‑
I'
annular
|；
[0022]然后，求取分割掩膜mask
differnce
，公式为：
[0023][0024]其中α为图像分割的阈值参数，建议取值范围为(0.05,0.1)；
[0025]最后，I'
annular
进行空域分割得到I”annular
，I”annular
＝I'
annular
·
mask
difference
。
[0026]优选的，步骤四具体为：
[0027]首先，求取混合照明模式下，两种照明模式对应的传递函数ATF
annular
,ATF
Kohler
，公式为：
[0028]ATF
annular
＝P
obj
*P
annular
[0029]ATF
Kohler
＝P
obj
*P
Kohler
[0030]其中，P
obj
是物镜的相干传递函数，公式为：
[0031][0032]ρ是极坐标系表示下频域的极径分量，λ是照明光波长，NA
obj
是物镜数值孔径，circ为圆函数，
[0033]P
annular
和P
Kohler
是环形照明和科勒照明两种照明模式下的照明函数，P
annular
的计算公式为：
[0034][0035]ρ
i1
,ρ
i2
为环形照明使用的照明环内外径所对应的照明光空间频率大小，计算公式为：
[0036][0037][0038]P
Kohler
的计算公式为：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法，其特征在于，步骤如下：步骤一.采集原始图像，分别对待测样品使用环形照明和科勒照明，拍摄两种照明模式下的光强图I
Kohler
,I
annular
，以及不放置待测样品时的两张背景光强图I
B_Kohler
,I
B_annular
；步骤二.对原始图像进行预处理，根据背景光强图I
B_Kohler
,I
B_annular
对I
Kohler
,I
annular
进行光强归一化处理得到I'
Kohler
,I'
annular
；步骤三.对I'
annular
进行空域分割，得到I”annular
；步骤四.对I'
Kohler
,I”annular
两张光强图进行频域加权相加融合，得到融合后的光强图I
fusion
；步骤五.对融合后的光强图I
fusion
进行反卷积得到I
deconv
。2.根据权利要求1所述的一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法，其特征在于，步骤一中，环形照明所使用的照明环外径为R，内径为r，照明环外径照明数值孔径为内径照明数值孔径为显微物镜的数值孔径为NA
obj
，照明光源距离待测样品的高度为h，且必须满足NA
R
＝NA
obj
，内径照明数值孔径NA
r
的典型范围为(0.9NA
R
,NA
R
)。3.根据权利要求1所述的一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法，其特征在于，步骤二中，对光强图I
Kohler
,I
annular
的亮度进行归一化的公式为：的亮度进行归一化的公式为：其中，I'
Kohler
,I'
annular
是处理后的光强图，mean( )是对括号内图像求取平均值，a为图像亮度控制系数，典型范围为(0.7,0.9)。4.根据权利要求1所述的一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法，其特征在于，步骤三具体为：首先，求取I'
Kohler
,I'
annular
灰度值分布差异的特性图I
difference
，I
difference
＝|I'
Kohler
‑
I'
annular
|；然后，求取分...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓磊，左超，陈钱，胡岩，束业峰，孙佳嵩，
申请(专利权)人：南京理工大学智能计算成像研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：