一种几丁质脱乙酰酶、编码基因、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，特别涉及一种几丁质脱乙酰酶、编码基因、制备方法及应用，本发明专利技术提供了一种新的几丁质脱乙酰酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并给出了其编码基因与表达方法，进一步发现其在生物酶法制备壳聚糖或纳米纤维中的应用。本发明专利技术的几丁质脱乙酰酶催化长链几丁质的酶活极高。酰酶催化长链几丁质的酶活极高。

【技术实现步骤摘要】
一种几丁质脱乙酰酶、编码基因、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种几丁质脱乙酰酶、编码基因、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]几丁质是仅次于纤维素第二大天然高分子的可再生资源。天然晶体几丁质的高聚合度以及较强的分子内和分子间氢键使其在一般溶剂中无法溶解，极大地限制了它的开发和商业应用。
[0003]几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA,EC 3.5.1.41)可催化几丁质去乙酰化制备高附加值、市场需求量大的壳聚糖和几丁质纳米纤维，壳聚糖和几丁质纳米纤维具有安全无毒、可生物降解和生物相容性好等特性，被广泛应用于医药、化妆品和生物修复等领域。相比传统的物理法和化学法制备壳聚糖和几丁质纳米纤维，运用CDA制备的壳聚糖具有分子量大、分子分布范围窄、脱乙酰位置一致和脱乙酰度比较彻底等优点，制备的几丁质纳米纤维其机械特性、纳米纤维长度和宽度等显著提高，且CDA酶法生产工艺具有安全可控、绿色高效等优势。但是目前已报道的CDA中，仅有极少数CDA对晶体几丁质有较低催化活性，更无满足商业上对高活性催化晶体几丁质CDA的需求，这已成为CDA工业化制备壳聚糖、几丁质纳米纤维等高附加值产物的技术瓶颈。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在提供一种新的几丁质脱乙酰酶，其具有更高的酶活，以满足工业化需求。
[0005]本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种几丁质脱乙酰酶，所述几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]编码前述所述的几丁质脱乙酰酶的编码基因。
[0008]优选的，所述编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]前述所述的几丁质脱乙酰酶的制备方法，包括如下步骤：将前述任一项所述的编码基因克隆到表达载体pET
‑
28a上得到重组载体PET
‑
28a
‑
AsCDA，将重组载体PET
‑
28a
‑
AsCDA转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，培养大肠杆菌至OD600为0.55～0.65，IPTG诱导表达得到。
[0010]优选的，所述IPTG诱导浓度为终浓度0.35mM～0.45mM，所述BL21大肠杆菌培养温度为36～38℃。
[0011]前述所述的几丁质脱乙酰酶在含乙酰基多糖的脱乙酰基中的应用。
[0012]优选的，所述的含乙酰基多糖选自长链几丁质。
[0013]优选的，所述的长链几丁质选自α
‑
几丁质、β
‑
几丁质、胶体几丁质或γ
‑
几丁质。
[0014]前述所述的几丁质脱乙酰酶在几丁质生物酶法制备壳聚糖或纳米纤维中的应用。
[0015]优选的，所述应用最佳pH为6～9，最佳温度为25～35℃。
[0016]优选的，所述应用最佳pH为7，最佳温度为30℃。
[0017]优选的，所述应用时，加入下述一种或多种金属离子促进反应：Zn
2+
、Mg
2+
、Ca
2+
、Ni
+
、 Mn
2+
、Ag
+
、Sr
2+
、Fe
3+
。
[0018]优选的，所述金属离子的终浓度为0.5～1.5mmol/L。
[0019]优选的，所述金属离子的终浓度为1mmol/L。
[0020]有益效果
[0021]本专利技术制备的申氏不动杆菌几丁质脱乙酰酶AsCDA重组酶具有较高的几丁质脱乙酰酶活性，尤其是催化长链几丁质的比酶活478.96U/mg为目前已公开发表的最高活性，可催化自然界中的几丁质脱去的乙酰基制备壳聚糖。
[0022]几丁质脱乙酰酶AsCDA可实现工业上酶法催化几丁质制备壳聚糖的需求，且可被广泛应用于食品科学、生物医药、化工材料等方面，有良好的应用前景。
附图说明
[0023]图1：相关基因片段电泳图。
[0024]图2：对照组及相关上清等物质电泳图。
[0025]图3：重组AsCDA的酶活测定。
[0026]图4：重组AsCDA的酶学特性分析。
[0027]图5：重组AsCDA催化长链几丁质脱乙酰基电镜扫描图。
[0028]图6：重组AsCDA催化长链几丁质脱乙酰红外光谱图测定。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本专利技术及其应用或使用的任何限制。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]术语限定
[0031]长链几丁质：本专利技术中的长链几丁质指的是(C8H
13
NO5)
n
，n大于20。其包括天然几丁质、胶体几丁质等，例如本文提到的α
‑
几丁质、β
‑
几丁质、胶体几丁质，或者γ
‑
几丁质等。天然几丁质具有高聚合度，致密有序的结晶结构和较强的分子内和分子间氢键使其在一般溶剂中无法溶解，故又称为晶体几丁质。
[0032]通过查找文献，我们发现其他的几丁质脱乙酰酶的脱乙酰能力均不高，如下表所示。
[0033]表1具有催化晶体几丁质脱乙酰活性CDA的酶学特性
[0034][0035]1.Z.Liu,L.M.Gay,T.R.Tuveng,J.W.Agger,B.Westereng,G.Mathiesen,S.J.Horn,G.Vaaje
‑
Kolstad,D.vanAaltenandV.Eijsink,SciRep,2017,7,1746.
[0036]2.X.Y.Zhu,Y.Zhao,H.D.Zhang,W.X.Wang,H.H.CongandH.Yin,MARDRUGS,2019,17.
[0037]3.T.R.Tuveng,U.Rothweiler,G.Udatha,G.Vaaje
‑
Kolstad,A.SmalasandV.Eijsink,PLOSONE,2017,12,e187544.
[0038]4.J.Cai,J.Yang,Y.Du,L.Fan,Y.Qiu,J.LiandJ.F.Kennedy,CARBOHYDPOLYM,2006,65,211
‑
217.
[0039]5.B.Shrestha,K.Blondeau,W.F.StevensandF.L.Hegarat,ProteinExprPurif,2004,38,196
‑
204.
[0040]6.J.Ch本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种几丁质脱乙酰酶，其特征在于，所述几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述的几丁质脱乙酰酶的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。4.权利要求1所述的几丁质脱乙酰酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求2～3任一项所述的编码基因克隆到表达载体pET
‑
28a上得到重组载体PET
‑
28a
‑
AsCDA，将重组载体PET
‑
28a
‑
AsCDA转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，培养大肠杆菌至OD600为0.55～0.65，IPTG诱导表达得到。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述IPTG诱导浓度为终浓度0.35mM～0.45mM，所述BL21大肠杆菌培养温度为36～38℃。6.权利要求1所述的几丁质脱乙酰酶在含乙酰基多糖的脱乙酰基中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的含乙酰基多糖选自长链几丁质。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光，房耀维，刘姝，侯晓月，安佳，王毓涵，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：