一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turnon”型荧光传感器制造技术

本发明专利技术公开了一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，其特征在于：所述的传感器包含一条具有茎环结构的双标记DNA CCP2和一条双螺旋DNA T18AB，所述的双标记DNA序列如所示SEQ ID No.1，所述的双螺旋DNA序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。No.3所示。No.3所示。

【技术实现步骤摘要】
一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器


[0001]本专利技术涉及一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turnon”型荧光传感器，属于生物传感器领域。

技术介绍

[0002]三螺旋DNA在分子识别、基因表达调控和基因疾病的诊疗等方面有重要作 用，一直是人们关注的热点。三螺旋DNA通常由第三条链(TFO)与同型嘌呤
· 同型嘧啶双螺旋DNA(dsDNA)形成。平行三螺旋DNA因为TFO中胞嘧啶碱基 需要质子化才能形成C
·
G*C
+
三碱基体(其中
·
表示Watson
‑
Crick键，*表示 Hoogsteen键)，在生理条件下很难形成。构成三螺旋DNA的Hoogsteen氢键 的稳定性也远低于双螺旋DNA的Watson
‑
Crick氢键。由于这些原因，三螺旋 DNA在生理条件下的实际应用大大受限，克服这一限制的方法就是筛选嵌入剂 增加三螺旋DNA的稳定性。因此建立筛选三螺旋DNA嵌入剂的传感器具有重 要意义。
[0003]筛选三螺旋DNA嵌入剂的方法有金纳米溶胶法、高效液相色谱
‑
质谱法、竞 争透析法、紫外
‑
可见分光光度法解链实验等。但这些方法大多劳动强度较大， 相对较复杂和缓慢，有些还需要昂贵的精密设备。相对而言，荧光法具有操作 简单、成本低、灵敏度高等优点，得到广泛应用。Tseng等报道了一种筛选三螺 旋DNA稳定试剂的“turn/>‑
off”型荧光法。然而，最理想的荧光传感器具有“turn
‑
on
”ꢀ
型特性，以降低背景噪声，同时具有高灵敏度和高选择性。Vasquez等构建了一 种嵌入剂置换法用于筛选三螺旋DNA稳定试剂，该方法虽然简单、快速，但要 求被筛选的稳定试剂与三螺旋DNA的键合能力必须高于嵌入剂
‑
甲氧檗因。
[0004]分子信标(Molecular beacon，MB)最早由Tyagi和Kramer于1996年提出， 是一种中间为环、两端碱基互补为茎的发夹结构寡聚核苷酸序列，其茎的两端分 别标记有荧光基团和猝灭基团。MB已成为一种DNA探针，广泛应用于各种目 标分析物，如凝血酶、转录因子、核酸、信使RNA(mRNA)、重金属离子、 microRNA(miRNA)等。这里，专利技术人拟利用MB与目标双螺旋DNA之间三螺 旋DNA的形成需要嵌入剂的稳定作用，构建了一种“turn
‑
on”型荧光法筛选稳 定三螺旋DNA嵌入剂的传感器。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是：提供一种基于分子信标筛选三螺旋 DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，解决构成三螺旋DNA的 Hoogsteen氢键稳定性较差的技术问题。
[0006]本专利技术的技术方案是：一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂 的“turn on”型荧光传感器，所述的传感器包含一条具有茎环结构 的双标记DNA CCP2和一条双螺旋DNA T18AB，所述的双标记DNA序 列如所示SEQ ID No.1，所述的双螺旋DNA序列如SEQ ID No.2和SEQID No.3所示。
[0007]进一步的，所述的传感器还包含精胺。
[0008]进一步的，所述的传感器的工作条件为：5～50mmol/L PBS作为 工作缓冲溶液，0.01～0.15mmol/L精胺，传感器序列CCP2与T
18AB
均 为20～200nmol/L。
[0009]进一步的，所述的PBS中包含15mmol/L NaNO3。
[0010]进一步的，所述的嵌入剂包含黄藤素和新霉素。
[0011]优选的，所述的传感器的工作条件为：20mmol/L PBS作为工作 缓冲溶液，0.06mmol/L精胺，传感器序列CCP2与T
18AB
均为100 nmol/L。
[0012]本专利技术的有益效果：本专利技术涉及一条具有茎环结构的双标记DNA (CCP2)和一条特定的双螺旋DNA(T
18AB
)作为筛选三螺旋DNA嵌入 剂的传感器序列。当没有嵌入剂(有机药物分子)存在时，双标记 DNA两端碱基互补配对形成茎环结构，标记的荧光团与淬灭基团密切 靠近，荧光信号相对较弱；当有嵌入剂存在时，由于嵌入剂具有稳定 三螺旋DNA的作用，两条传感器序列形成分子间三螺旋DNA，双标记 DNA的茎环结构打开，荧光信号增强，基于这一原理构筑了双标记荧 光法筛选三螺旋DNA嵌入剂的传感器。优化后确定传感器的实验条件 为：20mmol/L PBS(pH 7.5，含15mmol/L NaNO3)作为工作缓冲溶 液，0.06mmol/L精胺，传感器序列CCP2与T
18AB
均为100nmol/L。 采用该传感器方法对黄藤素、黄连素、新霉素、卡那霉素、EB、DAPI、 四环素等有机药物分子进行嵌入剂筛选，通过多次实验发现加入黄藤 素、黄连素、新霉素三种药物分子的荧光强度增加较为明显，说明这 些药物分子有稳定三螺旋DNA的嵌入剂效果，然而卡那霉素、EB、 DAPI、四环素等则没有明显的嵌入剂作用。对药物本身的荧光及其对 荧光团的干扰进行了测试，发现信号都非常弱，则三种药物分子的加 入导致荧光增强是由于其稳定三螺旋DNA引起。采用圆二色谱对有无 有机药物分子的溶液进行研究，发现存在黄藤素、黄连素、新霉素时 三螺旋DNA的特征圆二色谱峰强度明显增加，与荧光光谱结果一致。。
附图说明
[0013]图1为实验可行性分析，(a)100nmol/L CCP2；(b)a+100nmol/L T
18AB
；(c)b+4μmol/L黄连素；
[0014]图2为有无黄连素溶液的圆二色谱，(a)7.5μmol/L CCP2；(b) a+7.5μmol/L T
18AB
；(c)b+0.13mmol/L黄连素；
[0015]图3为精胺浓度的优化，(A)不同精胺浓度溶液在705nm的荧 光强度(a：无黄连素，b：有4μmol/L黄连素)；(B)不同精胺浓 度下加与不加黄连素的溶液荧光强度的增加百分比。精胺的浓度分别 为0.02mmol/L、0.06mmol/L、0.12mmol/L、0.18mmol/L、0.30 mmol/L；
[0016]图4为pH的优化，(A)不同pH溶液在705nm的荧光强度(a： 无黄连素，b：有4μmol/L黄连素)；(B)不同pH下加与不加黄连 素的溶液荧光强度的增加百分比；
[0017]图5为存在不同有机药物分子溶液的荧光光谱，(A)有机药物 分子分别为：(a)无药物分子，(b)8μmol/L新霉素，(c)8μmol/L 黄藤素，(d)8μmol/L黄连素，(e)2μmol/L Coralyne；(B) 有机药物分子分别为：(a)无药物分子，(f)8μmol/L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，其特征在于：所述的传感器包含一条具有茎环结构的双标记DNA CCP2和一条双螺旋DNA T18AB，所述的双标记DNA序列如所示SEQ ID No.1，所述的双螺旋DNA序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。2.根据权利要求1所述的一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，其特征在于：所述的传感器还包含精胺。3.根据权利要求1所述的一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，其特征在于：所述的传感器的工作条件为：5～50mmol/L PBS作为工作缓冲溶液，0.01～0.15mmol/L精胺，传感器序列CCP2...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖志友，司恒丹，杨晓丹，杨大航，
申请(专利权)人：贵州理工学院，
类型：发明
国别省市：