一种调控杨树木质部发育的PagARR9基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种调控杨树木质部发育的PagARR9基因及其应用，涉及生物基因工程技术领域；PagARR9基因的编码区核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术通过将PagARR9基因转入杨树，过量表达PagARR9的转基因杨树与野生型比较，木质部显著减少，通过CRISPR/Cas9敲除PagARR9基因，转基因杨树与野生型比较，木质部显著增加；说明细胞分裂素响应调节因子基因PagARR9，是调控杨树木质部发育的关键调节因子。本发明专利技术为木质部发育的调控手段提供了新的选择，在林木基因工程领域有重要应用价值。工程领域有重要应用价值。工程领域有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种调控杨树木质部发育的PagARR9基因及其应用


[0001]本专利技术涉及一种调控杨树木质部发育的PagARR9基因及其应用，特别涉及一种调控杨树木质部发育的细胞分裂素响应调节因子PagARR9基因及其应用，属于植物基因工程


技术介绍

[0002]现代林业担负着维护国土生态安全，满足木材需求等林产品战略物质供应的重要使命。随着经济的高速发展，我国对森林资源及林产品，特别是木材的消费需求量，持续大幅增长，现已成为世界第二大木材进口国。通过培育速生优质人工林新品种，提高有限造林地的木材产量和质量显得尤为重要。但是由于林木生长周期长、杂合度高等诸多自身生物学特性的限制，迄今对木材材性的遗传背景知之甚少，制约了人工林优质、高产目标的实现。
[0003]因此，揭示木材形成的遗传调控机理，不但可以丰富树木分子生物学理论，而且可以为采用分子育种技术对树木的材性改良提供支持。
[0004]林木形成层活动及次生维管组织发育受到多种外界环境因子及内源激素的协同作用，其中细胞分裂素对维管形成层的形成及分裂分化具有重要影响。通过调控细胞分裂素合成或代谢关键基因，增加或降低杨树形成层区域细胞分裂素浓度，显著增加或降低了形成层细胞活性和木材产量，但其调控形成层活动和木质部发育的分子机理尚不清楚。
[0005]细胞分裂素响应调节因子RRs是细胞分裂素信号转导过程中的关键因子，它们是细胞分裂素相关的调节基因中家族数目最多的，通过转录活性和蛋白活性的调节调控下游信号。
[0006]在拟南芥基因组中，编码所有的正向和负向细胞分裂素响应调节因子的ARR基因家族一共24个，不同成员之间存在功能冗余，共同参与对植物生长发育的调控。其中，A类ARR家族蛋白主要是作为负反馈调节细胞分裂素信号，B类ARR是一类植物特异转录因子，细胞分裂素信号途径依赖于主要的B类ARR的稳定性。
[0007]杨树作为木本模式植物，与拟南芥不同，顶端分生组织具有自我更新和持续分生能力，既可分化为顶芽又能形成花芽，维持多年生的特性，具有独特的分生组织发育调控机制。植物在长期进化过程中，许多重要调控因子在多年生木本植物中出现了同源基因家族数目的变化，基因功能可能也发生了分化。杨树中共发现33个RRs家族基因，不同成员之间有不同的表达模式，在不同的生物学过程中行使不同的功能。
[0008]因此，利用模式木本植物杨树，研究细胞分裂素响应调节因子RR调控木材形成的分子机制，筛选调控形成层活动和木材形成的特异ARR基因，对了解细胞分裂素调控形成层活动和木材产量以及杨树基因工程育种具有重要意义。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种能调控杨树木质部发育的基因PagARR9，并利用其表
达载体转化杨树，以期促进林木分子育种技术的发展，为优良树种的培育或筛选提供技术手段，同时为探索木质部发育的分子机理奠定基础。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0011]本专利技术基于对杨树细胞分裂素RRs家族成员的分析研究，鉴定出一个可以调控杨树木质部发育优势表达基因PagARR9，其编码区核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。PagARR9 CDS全长600bp，编码199个氨基酸和1个终止密码子。
[0012]在强启动子35S后插入木质部优势表达基因PagARR9，得到过表达载体，转化杨树，获得过表达植株。
[0013]利用保守序列设计sgRNA引物，构建PagARR9基因的CRISPR/Cas9载体，转化杨树，获得PagARR9敲除植株。
[0014]在具体研究过程中，利用上述载体通过农杆菌介导法转化银腺杨84K(Populus alba
×
P.glandulosa)，分别获得了PagARR9过表达株系(OE
‑
32、OE
‑
37、OE
‑
38)和基因敲除植株(C9
‑
2、C9
‑
7、C9
‑
21)。
[0015]对上述所得不同转基因株系进行表型及显微形态观察发现，PagARR9过表达株系显著变矮，木质部显著减少；而PagARR9敲除株系则显著增高，木质部显著增加。
[0016]以上研究结果证明，PagARR9对杨树株高及木质部发育具有关键调控作用，其在林木分子育种及优良品种选育中具有重要应用价值。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的主要有益技术效果在于：
[0018]本专利技术以银腺杨84k为材料，筛选鉴定出了PagARR9基因，基于其过表达和敲除植株的表型鉴定表明，其能够调控杨树木质部发育，说明PagARR9基因是调控杨树木质部发育的关键调节因子，为木质部发育的调控手段提供了新的选择，在林木基因工程领域有重要应用价值。
[0019]下面通过具体实施方式和附图对本专利技术作进一步说明，但并不意味着对本专利技术保护范围的限制。
附图说明
[0020]图1为本专利技术实施例1中杨树细胞分裂素响应调节因子PagARR9基因的组织表达特性分析图。
[0021]图2为本专利技术实施例1中野生型84K杨树与过量表达PagARR9的转基因杨树的转录水平定量检测图。
[0022]图3
‑
1为本专利技术实施例1中C9
‑
2敲除转基因植株检测结果。
[0023]图3
‑
2为本专利技术实施例1中C9
‑
7敲除转基因植株检测结果。
[0024]图3
‑
3为本专利技术实施例1中C9
‑
21敲除转基因植株检测结果。
[0025]图4为本专利技术实施例1中野生型84K杨树与过量表达PagARR9和基因敲除的转基因杨树株高表型比较图。
[0026]图5
‑
1为本专利技术实施例1中野生型84K杨树与过量表达PagARR9和基因敲除的转基因杨树地茎统计。
[0027]图5
‑
2为本专利技术实施例1中野生型84K杨树与过量表达PagARR9和基因敲除的转基因杨树株高统计。
[0028]图6为本专利技术实施例1中野生型84K杨树与过量表达PagARR9和基因敲除的转基因杨树木质部组织切片观察。
[0029]图7为本专利技术实施例1中野生型84K杨树与过量表达PagARR9和基因敲除的转基因杨树木质宽度统计。
具体实施方式
[0030]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明，以下实施例中未进行详细说明的操作可参照分子克隆，相关试剂盒使用说明的操作实现。
[0031]除非特别说明，下面实施例中所涉及的试剂均为市场上可购的常规试剂，所用的方法均为本
常用的方法。
[0032]实施例1：
[0033]一、杨树PagARR9基因组织表达分析
[0034]1.杨树PagARR9基因的克隆
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控杨树木质部发育的PagARR9基因，其编码区核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵树堂，刘颖丽，胡梦璇，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，
类型：发明
国别省市：