对灰翅夜蛾属的控制制造技术

披露了用于控制植物有害生物的方法。特别是，提供了对灰翅夜蛾属昆虫有害生物具有毒性的杀昆虫蛋白。还提供了包含密码子优化用于在植物中表达的编码杀昆虫蛋白的多核苷酸。还披露了制备所述杀昆虫蛋白的方法，和使用所述杀昆虫蛋白以及编码本发明专利技术的杀昆虫蛋白的多核苷酸的方法，例如，在转基因植物中赋予免于昆虫损害的保护。虫损害的保护。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对灰翅夜蛾属的控制
[0001]序列表
[0002]提供ASCII文本格式的序列表作为纸质副本的替代，该序列表是根据37C.F.R.
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1.821提交的，名称为“81889
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1_ST25.txt”，大小为308千字节，于2020年5月31日生成并经由EFS
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Web提交。这个序列表特此通过引用以其披露内容并入本说明书中。


[0003]本专利技术涉及有害生物昆虫控制、蛋白质工程化和植物分子生物学领域。更具体地，本专利技术涉及使用txp40基因或Txp40蛋白或使用Txp40蛋白与第二有害生物控制剂组合来控制灰翅夜蛾(Spodoptera)目中的有害生物昆虫，特别是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(秋粘虫；FAW)的方法。本专利技术还涉及保护作物(特别是玉米)对抗灰翅夜蛾(特别是FAW)，更特别是对抗Cry和/或Vip3抗性FAW的方法。本专利技术还提供了对FAW具有杀昆虫活性的Txp40蛋白毒素及其变体，该蛋白毒素及其变体的表达产生杀昆虫蛋白的核酸，以及制备这些杀昆虫蛋白和相应核酸的方法和使用这些杀昆虫蛋白和相应核酸来控制FAW有害生物的方法。本专利技术还涉及植物，尤其是单子叶植物，特别是玉米植物，其可被FAW侵染并且用可表达的txp40基因或用可表达的txp40基因和编码第二杀有害生物剂的基因转化。

技术介绍

[0004]灰翅夜蛾物种，包括草地贪夜蛾(秋粘虫，FAW)，是多种行播作物(包括玉米、棉花和大豆)的严重有害生物。FAW是巴西和其他南美国家玉米植物(玉蜀黍(Zea mays/maize))中最具破坏性的一致有害生物物种，导致产量减少高达57％。在某些年份，FAW还会对包括美国在内的其他国家的玉米造成重大经济损失。该昆虫的幼虫最初以叶组织为食，然后进入轮生体深处，对发育中的雄穗造成严重损害。由FAW引起的脱叶减少了光合面积，这可能使植物矮化并降低产量。FAW幼虫还通过在穗侧面钻孔和以发育中的谷粒为食而损害穗，从而降低谷物质量和产量。
[0005]历史上，已经使用合成杀昆虫剂实现了对玉米中FAW的控制。然而，这样的杀昆虫剂仅对幼虫有效，并且在它们深入到轮生体或穗之前有效。此外，在玉米密集栽培的地区，FAW群体已经进化出对几种杀昆虫剂的抗性，如λ
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三氯氟氰菊酯、毒死蜱、多杀菌素和氯芬奴隆。
[0006]其他FAW控制选择最近包括使用表达一种或多种来自苏云金芽孢杆菌(Bt)细菌的杀昆虫晶体蛋白(Cry蛋白)和/或营养期杀昆虫蛋白(VIP)的转基因玉米植物。迄今为止，来自Bt的最有效的FAW活性蛋白是营养期杀昆虫蛋白Vip3。只有非常少的来自Bt的Cry蛋白对FAW有活性。具有中度至高度活性的少数Cry蛋白包括Cry1Ab、Cry1Be、Cry1D、Cry1F、Cry1If、Cry1J和Cry2A。自大约2007年以来，表达这些Cry蛋白和Vip3蛋白中一种或多种的转基因玉米事件的商业发布为FAW管理提供了新的策略。目前，将含有这些所说的Bt事件的产品在FAW为有害生物的大部分主要玉米种植区上栽培。例如，将这些产品在巴西的80多个玉米种植区(约12.5百万公顷/年)栽培。快速采用含有具有抗FAW活性的Bt杀昆虫蛋白的产
品有助于减少对抗FAW的杀昆虫喷雾。然而，在一些情况下，Bt衍生蛋白在玉米植物中的持续表达对目标FAW有害生物群体造成了强烈的选择压力，有利于抗性的进化。例如，在巴西，FAW的田间群体已经进化出对转基因玉米产品中表达的Cry1F和Cry1Ab蛋白的抗性。FAW还在波多黎各和美国地区发展了对Cry1F玉米的抗性。在巴西，在FAW群体中也报道了对具有包含Cry1蛋白的叠加产物的产品的高频率抗性。相反，没有检测到对Vip3A蛋白的抗性。
[0007]仍然需要鉴定使用杀昆虫剂控制行播作物的昆虫有害生物的新型和有效的方法，所述杀昆虫剂为农民提供经济利益并且是环境可接受的。特别需要的是使用与来自Bt的现有杀昆虫蛋白(例如Cry蛋白和/或Vip3蛋白)具有不同作用模式的蛋白作为减轻抗性发展的方式来控制灰翅夜蛾属物种，特别是FAW的方法。此外，通过这些使环境负担最小化的产品(如通过转基因植物)递送昆虫控制剂是最令人希望的。

技术实现思路

[0008]鉴于这些需要，本专利技术提供了使用Txp40杀昆虫蛋白和Txp40杀昆虫蛋白的变体控制草地贪夜蛾(秋粘虫；FAW)和其他昆虫有害生物的方法。本专利技术还提供了灰翅夜蛾活性Txp40蛋白和与Txp40基本相同的变体Txp40蛋白。本专利技术的蛋白质令人惊讶地对FAW具有口服毒性，所述FAW是对许多类型的杀昆虫蛋白质，特别是对来自Bt的Cry蛋白质来说难以控制的昆虫有害生物物种。本专利技术还涉及编码Txp40蛋白质或变体Txp40蛋白质的重组密码子优化的多核苷酸。
[0009]本专利技术还包括含有本专利技术的重组多核苷酸的表达盒和载体；包括和能够表达这样的多核苷酸的植物或微生物；用这样的多核苷酸转化的植物，例如转基因玉米植物；这样的植物的子代，其含有稳定地掺入和以孟德尔方式遗传的多核苷酸，和/或这样的植物的种子和这样的子代。本专利技术还包括育种的方法，以将包含本专利技术的多核苷酸的转基因引入子代植物和各种玉米种质中。
[0010]本专利技术还包括含有Txp40或其变体的组合物和配制品，这些组合物和配制品能够抑制FAW存活、生长和/或繁殖的能力，或能够限制与FAW有关的损害或作物植物的损失，例如将Txp40或其变体作为组合物或配制品的一部分施用至FAW侵染的区域或植物，或施用至预防性处理易感染FAW的区域或植物以赋予针对FAW有害生物的保护。
[0011]本专利技术进一步涉及制造Txp40或其变体的方法，以及使用本专利技术的多核苷酸的方法，例如，在微生物中控制FAW或者在转基因植物中赋予免于FAW损害的保护。
[0012]通过学习本专利技术的以下说明书和非限制性实例，本专利技术的其他方面和优点对于本领域的技术人员而言将变得清楚。
[0013]序列表中的序列简述
[0014]附上的序列表中列出的核苷酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写(如37C.F.R.
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1.822中所定义)表示。列出的核苷酸和氨基酸序列定义了具有以所述方式排列的核苷酸和氨基酸单体的分子(即，分别是多核苷酸和多肽)。列出的核苷酸和氨基酸序列还各自定义了多核苷酸或多肽(其包括以所述方式排列的核苷酸和氨基酸单体)的属。考虑到遗传密码的冗余性，应理解包括编码序列的核苷酸序列也描述了与由参考序列组成的多核苷酸编码相同的多肽的多核苷酸的属。还将理解，氨基酸序列描述了编码该多肽的多核苷酸ORF的属。
[0015]仅展示每个核酸序列的一条链，但通过对所呈现的链的任何提及，应理解为包括互补链。由于一级核苷酸序列的互补序列和反向互补序列必须由一级核酸序列披露，因此除非明确指出是其他情况(或者从出现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种控制灰翅夜蛾属昆虫有害生物的方法，其包括使所述灰翅夜蛾属昆虫有害生物与Txp40蛋白或包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列的其变体接触。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述灰翅夜蛾属昆虫有害生物是草地贪夜蛾昆虫有害生物。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述草地贪夜蛾昆虫有害生物对Cry蛋白和/或Vip3蛋白有抗性。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Vip3蛋白是Vip3A蛋白。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述Cry蛋白是Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1F、Cry1J或Cry2A蛋白。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤用被至少一种编码所述Txp40蛋白或其变体的多核苷酸转化的微生物进行。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤用包含至少一种编码所述Txp40蛋白或其变体的多核苷酸的植物或其部分进行。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物是玉米植物或其部分。9.根据权利要求2所述的方法，其中所述草地贪夜蛾与除所述Txp40蛋白或其变体之外的Cry蛋白和/或Vip3蛋白接触。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述Cry蛋白和/或所述Vip3蛋白选自下组，该组由以下组成：Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1F、Cry2A和Vip3蛋白。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述Txp40蛋白包含SEQ ID NO:1。12.一种嵌合基因，其包含与异源核酸分子可操作地连接的启动子，所述异源核酸分子包含编码对灰翅夜蛾属昆虫有害生物具有杀昆虫活性的Txp40蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)是SEQ ID NO:3
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5或11
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73中的任一个；(b)与SEQ ID NO:3
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5或11
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73中的任一个具有至少95％同一性；(c)编码包含SEQ ID NO:1、2或74
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136中的任一个的氨基酸序列的蛋白质；(d)编码包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列的蛋白质；或(e)与(a)至(d)中的任一个的核苷酸序列互补。13.一种编码杀昆虫蛋白的核酸分子，其包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11
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73中任一个的核苷酸序列。14.一种杀昆虫蛋白，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:74
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136中任一个的氨基酸序列。15.一种包含根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：先正达农作物保护股份公司，
类型：发明
国别省市：