纳米化灵菌红素制剂及其在经济作物病毒病防治中的应用制造技术

本发明专利技术提出了基于DNA自组装的纳米化灵菌红素制剂及其制备方法和在农作物病毒防治中的应用，属于微生物次级代谢产物应用技术领域，能够解决纳米化灵菌红素制剂在防治主要经济作物病毒病(PVY、TMV、CMV)问题。该制剂是由灵菌红素和DNA四面体纳米材料制成的，灵菌红素可显著提升植物寄主热激蛋白(HSP70)的泛素化水平，促进寄主HSP70蛋白发生泛素化降解，降解或抑制Hsp70蛋白的表达，激活寄主植物天然免疫活性，实现对常见RNA病毒的抑制作用。本发明专利技术提供的纳米化灵菌红素制剂用于主要经济作物病毒病防治，可使灵菌红素的稳定性更强、作用更加持久，能起到良好的病毒病防治效果，本发明专利技术在经济作物多病毒防治领域具有良好的应用前景。用前景。用前景。

【技术实现步骤摘要】
纳米化灵菌红素制剂及其在经济作物病毒病防治中的应用


[0001]本专利技术属于微生物次级代谢产物应用
，具体涉及一种灵菌红素在抗经济作物病毒病药物中新的制剂方式和在经济作物病毒病防治中的新应用。

技术介绍

[0002]马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)的宿主广泛，可侵染多种植物，特别是茄科植物，其次还有藜科和豆科植物，是全世界范围内的一种病毒，可引起植物叶脉坏死，造成重大的经济损失，但该病毒至今仍缺少有效的防治措施。
[0003]由烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)引起的烟草花叶病毒病，为危害烟草的最严重病害之一。TMV抗逆性强，传播途径简单，并且寄主范围广。有研究报道TMV能侵染马铃薯、番茄、烟草等350余种经济作物，病叶经120℃高温处理10min后侵染活性仍较高，在干烟叶中能存活52年之久。植株若在苗期感染TMV则更加影响产量及品质。
[0004]黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员，能侵染1000多种单、双子叶植物，可被75种蚜虫传播，有些分离物还可通过种子传播，具有寄主多、分布广等特点，是造成农作物危害最大的植物病毒之一。
[0005]灵菌红素类化合物(Prodigiosins，PGs)是含有灵菌红素(Prodigiosin，PG)三吡咯骨架的一类化合物，具有广泛的生物活性，如抗细菌、免疫抑制、抗肿瘤、抗病毒等。1978年Fullan N P等报道了PG体内抗肿瘤作用。此后PG及其衍生物在抗肿瘤研究方面的应用受到持续关注。代表性化合物包括UP、GX15
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070、mcPG等。其中，GX15
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070是目前唯一进入Ⅲ期临床试验的PGs，有望成为新型抗癌药物。但高剂量引起的神经毒性一定程度限制了其临床上的独立用药。此外，PGs在食品、医药等行业都有潜在的应用价值。近年来，有研究表明灵菌红素能够提高植物对病毒的免疫诱导抗性，可诱导溶酶体等细胞器中酸性环境碱化，阻止病毒与宿主细胞膜相融合，也可抑制某些利于病毒复制增殖的通路。
[0006]热激蛋白(Heat shock proteins，Hsp)是植物细胞中重要的分子伴侣，是维持生命活动的重要功能蛋白。热激蛋白与病毒感染周期的多个方面也密切相关，如病毒粒子的组装和拆卸、细胞进入、基因组复制和病毒基因表达等，大量研究表明，Hsp70的表达与病毒的复制水平有关。
[0007]泛素化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，在天然免疫信号转导中发挥重要作用，可在天然免疫转导过程中与多个关键接头分子结合，进而调控天然免疫信号通路。泛素
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蛋白酶体途径是最先被发现的，也是一种普遍的内源蛋白质降解方式，Hsp70的泛素化降解有利于抑制多种病毒的复制增殖。
[0008]纳米农药是将纳米材料和纳米技术应用到农药的研制中，开发的具有良好药效的农药。纳米农药不仅是农药剂型的简单变化，农药加工过程的实质性改变会导致农药施用后出现显著的效果。纳米材料的量子尺寸和宏观量子隧道效应以及极大的比表面积赋予其强效和广谱的抗菌、抗病毒功能，达到对某些植物病毒的良好防治效果。作为一种微生物的
天然次生代谢物，灵菌红素在自然环境中易降解、药效短，因此使用溶液进行叶面喷施、根部浇灌等方法并不能有效防治植物病毒。选择一种合适的纳米载体，可能会有助于提高灵菌红素的靶向选择性施药能力和药效，具有可观的前景。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种纳米化灵菌红素制剂的制备及其在经济作物病毒病防治中的应用，该制剂具有稳定性强、不易被降解、促进灵菌红素在植物体内穿梭和转运来增加药效等优点，提高植物体内Hsp70的泛素化水平，能有效防治PVY、TMV、CMV等病毒。
[0010]为了达到上述目的，本专利技术采用的具体技术方案为：一种纳米化灵菌红素制剂，所述纳米化灵菌红素制剂是由灵菌红素和DNA四面体纳米材料制成的。
[0011]所述灵菌红素为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescen
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S3)的次生代谢产物。
[0012]所述DNA四面体由四条设计好的单链DNA(ssDNA)组装而成，所述DNA四面体的制备方法为：在200μL离心管中加入适当的等摩尔浓度的ssDNAs到TM缓冲液中，总体积为100μL；轻轻涡旋混合，然后在95℃下加热10分钟，迅速冷却到4℃，在热循环仪中保持20分钟以维持四面体结构。
[0013]所述纳米化灵菌红素制剂为液态或固态制剂。
[0014]本专利技术还提供了一种纳米化灵菌红素制剂的制备方法，将灵菌红素溶液与DNA四面体纳米材料溶液在常温下孵育24h。
[0015]所述DNA四面体和灵菌红素的质量比是1:5。
[0016]本专利技术还提供了纳米化灵菌红素制剂的在经济作物病毒病防治中的应用。
[0017]所述纳米化灵菌红素制剂的使用方法是将成品溶液均匀喷施在植物叶片上。
[0018]所述纳米化灵菌红素制剂施用于烟草、番茄、辣椒或马铃薯。
[0019]所述纳米化灵菌红素制剂处理PVY、TMV、CMV感染的植株，促进寄主植株HSP70蛋白发生泛素化，降解或抑制Hsp70蛋白的表达，激活寄主植物天然免疫活性，诱导植物寄主产生系统抗性。
[0020]本专利技术通过处理分别感染PVY、TMV、CMV的植株，利用Western blot技术验证纳米化灵菌红素制剂喷施本氏烟后整体泛素化水平上升，同时寄主中Hsp70蛋白水平发生下降。利用泛素化抑制剂MG
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132抑制寄主体内的泛素化修饰，探究泛素化在灵菌红素抗病毒病的作用机制中的作用，结果显示灵菌红素诱导抗性是通过抑制Hsp70蛋白的表达来达到抗病毒效果。抑制宿主泛素化修饰水平则抑制Hsp70介导的灵菌红素抗病毒抗性，说明Hsp70的泛素化修饰可能在灵菌红素抗病毒抗性作用机制中起重要作用。证明纳米化灵菌红素制剂可以促进寄主植株HSP70蛋白发生泛素化，降解或抑制Hsp70蛋白的表达，激活寄主植物天然免疫活性，诱导植物寄主产生系统抗性。
[0021]本专利技术所述灵菌红素为申请号为201310323749.5、专利技术名称为《抗TMV的三吡咯环类化合物及其制备方法和用途》中所获得的灵菌红素。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：
[0023](1)本专利技术提供了纳米化灵菌红素制剂在经济作物病毒病防治中的应用，通过与DNA四面体纳米材料的结合提高促进植物免疫诱导抗性的灵菌红素的稳定性，使其能更稳定持久的引起植物体内的免疫诱导抗性；
[0024](2)本专利技术提供的制剂除了能增加灵菌红素的稳定性，还能促进灵菌红素在植物体内的转运和穿梭，达到增加药效的目的；
[0025](3)本专利技术提供的制剂灵菌红素浓度为500μg/ml，DNA四面体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳米化灵菌红素制剂，其特征在于，所述纳米化灵菌红素制剂是由灵菌红素和DNA四面体纳米材料制成的。2.根据权利要求1所述的一种纳米化灵菌红素制剂，其特征在于，所述灵菌红素为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescen
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S3)的次生代谢产物。3.根据权利要求1所述的一种纳米化灵菌红素制剂，其特征在于，所述DNA四面体由四条设计好的单链DNA(ssDNA)组装而成，所述DNA四面体的制备方法为：在200μL离心管中加入适当的等摩尔浓度的ssDNAs到TM缓冲液中，总体积为100μL；轻轻涡旋混合，然后在95℃下加热10分钟，迅速冷却到4℃，在热循环仪中保持20分钟以维持四面体结构。4.根据权利要求1所述的一种纳米化灵菌红素制剂，其特征在于，所述纳米化灵菌红素制剂为液态或固态制剂。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨金广，葛明，焦裕冰，李莹，张万红，王凤龙，申莉莉，宋丽云，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所中国烟草总公司青州烟草研究所，
类型：发明
国别省市：