一种基于特征性成分α3制造技术

本发明专利技术涉及一种掺假羊乳的鉴别方法，具体涉及一种基于特征性成分α3

【技术实现步骤摘要】
一种基于特征性成分
α3’‑
半乳糖基乳糖及N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法


[0001]本专利技术涉及一种掺假羊乳的鉴别方法，具体涉及一种基于α3
’‑
半乳糖基乳糖及N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法。

技术介绍

[0002]羊乳营养丰富，具有易消化吸收，低致敏等优点。研究发现，羊乳中几种主要过敏源蛋白的占比低于牛乳，如：α
S1
‑
酪蛋白、β
‑
乳球蛋白和α
‑
乳白蛋白，且乳糖的含量低于牛乳，更适合乳糖不耐受人群食用。我国奶山羊资源有限，奶山羊泌乳期短，产量低，且羊乳的价格远高于牛乳，这导致不法商贩在利益的驱动下将牛乳或者水掺入羊乳中以此牟利。这种掺假行为损害了消费者的利益和市场秩序，影响了乳品产业健康发展。因此，建立一种高效精准的检测体系用于鉴别羊乳掺假现象尤为重要。
[0003]目前，羊乳制品掺牛乳最常见的形式是用部分牛乳代替羊乳或者将牛乳清粉掺入羊乳中。由于羊乳和牛乳的营养成分存在差异，如：蛋白质、脂肪、和DNA分子等，因此上述物质可作为羊乳掺假牛乳的研究基质。现阶段，羊乳掺假牛乳的检测方法主要以蛋白质检测、核酸检测以及脂肪酸检测为主。
[0004]基于蛋白质掺假检测的技术手段主要有电泳分析法和酶联免疫吸附法等。电泳分析法的成本低、可操作性强，但重现性差；酶联免疫吸附法灵敏度高，特异性强，但特异性抗体制备存在困难，且成本高；与此同时，以蛋白质为基质的检测方法也存在一定局限性：第一，对于羊乳掺假牛乳清粉的乳制品来说，由于乳清粉中不含有酪蛋白成分，造成该方法的普适性受限；第二，对于经高温处理的乳制品来说，由于部分蛋白质会因高温发生变性，导致该方法缺乏准确性。
[0005]基于核酸检测的技术手段主要有PCR技术、qPCR技术和等温扩增技术等。PCR技术特异性、灵敏度高，但只能定性不能定量分析；qPCR技术不仅特异性强、灵敏度高，而且可以定性定量分析，但探针成本较高、操作步骤复杂。
[0006]基于脂肪酸检测的技术手段主要有气相色谱法，该方法检测灵敏度低，同时并不适用于羊乳中掺入脱脂牛乳的检测。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种基于特征性成分α3
’‑
半乳糖基乳糖及N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，以克服现有以蛋白质为基质的检测方法存在普适性及准确性较低、电泳分析法存在的重现性差、酶联免疫吸附法存在成本高、PCR技术不能定量分析、qPCR技术成本较高、操作步骤复杂、基于脂肪酸检测存在的检测灵敏度低，同时不适用于羊乳中掺入脱脂牛乳的检测等问题。
[0008]哺乳动物乳汁中的营养成分由乳糖、脂质、蛋白质和低聚糖等组成，其中寡糖是除乳糖和脂质外的第三大类固形物，由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N
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乙酰氨基葡萄糖
(GlcNAc)、岩藻糖(Fuc)、N
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乙酰神经氨酸和N
‑
羟乙酰神经氨酸等六种单糖残基组成，并以不同糖苷键构成丰富的结构类型。不同种类哺乳动物的乳汁中寡糖的含量和种类存在较大差异，牛乳中寡糖的含量为30
‑
60mg/L，而羊乳中寡糖的含量是牛乳的4—10倍(0.25
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0.30g/L)。在研究过程中，我们发现羊乳中特征性寡糖半乳糖基乳糖含量最高，约占85％，并发现该糖链具有五种同分异构体，分别为：β6'
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GL,α6'
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GL,β4'
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GL,α3'
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GL和β3'
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GL，这几种寡糖的含量分布在羊乳和牛乳中存在显著性差异，此外，在牛乳中检测到特征性寡糖N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖，该糖链在羊乳中是微量。同时，经过检索，目前以特征性寡糖为基质对掺假羊乳鉴别的研究还未见报道。
[0009]本专利技术首先对乳寡糖进行高效分离分析，并定性定量比较了不同掺假程度下羊乳和牛乳中特征性寡糖半乳糖基乳糖异构体以及N
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乙酰葡糖胺基乳糖的含量，建立了一种基于特征性成分α3
’‑
GL及N
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乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳的鉴别方法，为乳寡糖的应用提供新方向，为掺假羊乳鉴别方法的开发提供新思路。
[0010]本专利技术的技术方案是提供一种基于特征性成分α3
’‑
半乳糖基乳糖及N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
[0011]步骤1、使用高效液相色谱技术对纯羊乳和纯牛乳游离寡糖中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
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乙酰葡糖胺基乳糖进行定性定量分析；
[0012]步骤2、基于步骤1的定性定量分析结果，建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
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乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程；
[0013]步骤3、根据步骤2建立的线性回归方程，确定待测羊乳中是否掺假牛乳及掺假程度。
[0014]进一步地，骤1具体为：
[0015]步骤1.1、通过离心、醇沉和石墨碳柱分离除去纯羊乳、纯牛乳中的脂肪、蛋白质和大量乳糖，获得游离寡糖；
[0016]步骤1.2、对游离寡糖进行AEAB衍生化标记；
[0017]步骤1.3、基于HPLC分离分析方法，利用反相C18柱对纯羊乳和纯牛乳中游离寡糖衍生物进行分离分析，获得等体积的纯羊乳和纯牛乳游离寡糖中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖的含量。
[0018]进一步地，步骤2具体为：
[0019]步骤2.1、制作不同添加比例的牛乳和羊乳混合物；
[0020]步骤2.2、利用步骤1的方法，对上述等体积混合物中游离寡糖衍生物进行分离纯化，获得其中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖的含量；
[0021]步骤2.3、基于步骤1及步骤2.2的结果，建立含有不同百分比牛乳的羊乳混合物与其中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖的含量线性回归方程。
[0022]进一步地，步骤2.3具体为：
[0023]步骤2.31、分别对等体积纯羊乳和纯牛乳中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
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乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积进行积分；
[0024]步骤2.32、将纯羊乳中α3
’‑
半乳糖基乳糖的峰面积和纯牛乳中α3
’‑
半乳糖基乳糖的峰面积进行加合，将加合后的峰面积定义为α3
’‑
半乳糖基乳糖的总峰面积；将纯羊乳中N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积和纯牛乳中N...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于特征性成分α3
’‑
半乳糖基乳糖及N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、使用高效液相色谱技术对纯羊乳和纯牛乳游离寡糖中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖进行定性定量分析；步骤2、基于步骤1的定性定量分析结果，建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程；步骤3、根据步骤2建立的线性回归方程，确定待测羊乳中是否掺假牛乳及掺假程度。2.根据权利要求1所述的基于α3
’‑
半乳糖基乳糖及N
‑
乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，步骤1具体为：步骤1.1、通过离心、醇沉和石墨碳柱分离除去纯羊乳、纯牛乳中的脂肪、蛋白质和大量乳糖，获得游离寡糖；步骤1.2、对游离寡糖进行AEAB衍生化标记；步骤1.3、基于HPLC分离分析方法，利用反相C18柱对纯羊乳和纯牛乳中游离寡糖衍生物进行分离分析，获得等体积的纯羊乳和纯牛乳游离寡糖中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
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乙酰葡糖胺基乳糖的含量。3.根据权利要求2所述的基于α3
’‑
半乳糖基乳糖及N
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乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，步骤2具体为：步骤2.1、制作不同添加比例的牛乳和羊乳混合物；步骤2.2、利用步骤1的方法，对上述等体积混合物中游离寡糖衍生物进行分离纯化，获得其中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
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乙酰葡糖胺基乳糖的含量；步骤2.3、基于步骤1及步骤2.2的结果，建立含有不同百分比牛乳的羊乳混合物与其中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
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乙酰葡糖胺基乳糖的含量线性回归方程。4.根据权利要求3所述的基于α3
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半乳糖基乳糖及N
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乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，步骤2.3具体为：步骤2.31、分别对等体积纯羊乳和纯牛乳中α3
’‑
半乳糖基乳糖和N
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乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积进行积分；步骤2.32、将纯羊乳中α3
’‑
半乳糖基乳糖的峰面积和纯牛乳中α3
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半乳糖基乳糖的峰面积进行加合，将加合后的峰面积定义为α3
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半乳糖基乳糖的总峰面积；将纯羊乳中N
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乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积和纯牛乳中N
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乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积进行加合，将加合后的峰面积定义为N
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乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积；步骤2.33、计算不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3
’‑
半乳糖基乳糖的峰面积与上述α3
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半乳糖基乳糖的总峰面积的比值；计算不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中N
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乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积与上述N
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乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积的比值；步骤2.34、利用不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3
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半乳糖基乳糖的峰面积与上述α3
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半乳糖基乳糖的总峰面积的比值，建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3
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半乳糖基乳糖含量的线性回归方程；利用不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中N
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乙酰葡糖胺基乳糖的峰面积与上述N
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乙酰葡糖胺基乳糖的总峰面积的比值，建立不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中N
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乙酰葡糖胺基乳糖含量的线性回归方程。
5.根据权利要求4所述的基于α3
’‑
半乳糖基乳糖及N
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乙酰葡糖胺基乳糖的掺假羊乳鉴别方法，其特征在于，步骤2.34中：不同添加比例的牛乳和羊乳混合物与其中α3
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半乳糖基乳糖含量的线性回归方程为：y＝
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0.4662x+0.7339；其中x为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物，y为不同添加比例的牛乳和羊乳混合物中α3
’‑
半乳糖基乳糖的峰面积与上述α...

【专利技术属性】
技术研发人员：王仲孚，路宇，王心怡，黄琳娟，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：