一种观察两年生马尾松茎干木质素沉积的切片制备方法技术

本发明专利技术公开了一种观察两年生马尾松茎干木质素沉积的切片制备方法，包括取样、固定、软化、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片、脱蜡、染色及封片处理步骤。通过本发明专利技术的技术方案，较传统的徒手切片观察木质素沉积以及传统石蜡切片方法观察茎干组织结构更具高效性和完整性，并具有多功能性，能够获得一种完整清晰观察马尾松茎干木质素沉积的切片，且能够同时观察到清晰完整的茎干组织结构，为探索生马尾松茎干的次生生长过程奠定基础。尾松茎干的次生生长过程奠定基础。尾松茎干的次生生长过程奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种观察两年生马尾松茎干木质素沉积的切片制备方法


[0001]本专利技术涉及马尾松茎干切片
，尤其涉及一种观察两年生马尾松茎干木质素沉积的切片制备方法。

技术介绍

[0002]马尾松(Pinus massoniana Lamb.)为松科(Pinaceae)、松属(Pinus)乔木，主要分布在我国亚热带东部湿润地区，具有分布广、用途广泛、全树综合利用程度高等特点。马尾松是我国特有的速生树种，同时是南方主要造林树种之一，在木材加工业中具有重要的利用价值。对两年生马尾松的茎干进行木质素沉积的观察，可以更好的了解马尾松茎干的次生生长过程，为马尾松大径材培育工作提供参考。
[0003]木质素沉积观察通常采用徒手切片，但是马尾松茎干为较硬组织，徒手切片几乎难以制作，而石蜡切片是观察植物组织解剖结构的常见方法，具有操作相对简单，成本不高，可制作永久切片等特点。因此提供一种能够完整清晰观察马尾松茎干木质素沉积的方法是亟需解决的问题，将石蜡切片与木质素沉积染色相结合，可以对马尾松茎干的组织结构及木质素沉积同时进行更好的观察，为探索生马尾松茎干的次生生长过程奠定基础。

技术实现思路

[0004]针对上述存在的问题，本专利技术旨在提供一种观察两年生马尾松茎干木质素沉积的切片制备方法，克服现有技术的不足，解决马尾松茎干材质硬、组织细胞壁厚，无法进行徒手切片、切片不完整、不清晰、染色难等问题。并且该切片方法易于观察马尾松茎干木质素沉积，解决了传统木质素沉积难以在较硬木本植物上观察，以及石蜡切片在硬度较高的材料中切片易破、易碎等问题。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种观察两年生马尾松茎干木质素沉积的切片制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0006]1)取样及固定
[0007]取两年生马尾松茎底部5mm左右长茎段置于FAA固定液中，4℃冰箱固定48h以上；
[0008]2)软化
[0009]从FAA固定液中将茎段取出，用蒸馏水将茎段表面的固定液冲洗干净，然后将茎段置于过氧化氢
‑
冰醋酸混合溶液放置5h后，再转入装有70％叔丁醇
‑
丙三醇混合溶液中，并封闭置于50℃恒温箱中处理7d，每天更换一次70％叔丁醇
‑
丙三醇混合溶液；
[0010]3)脱水
[0011]将软化好的茎段用70％乙醇进行首次脱水，期间进行多次溶液的更换，每次在70％乙醇中脱水2h，之后置于4℃冰箱中过夜存放；次日用85
‑
100％浓度梯度递增的乙醇接着进行脱水；
[0012]4)透明
[0013]将脱水完后的茎段在100％二甲苯+无水乙醇溶液中过渡2h，过渡完成后在100％
二甲苯溶液中透明两次，时间均为2h，透明结束后置于100％二甲苯+石蜡溶液中，在40℃恒温箱中进行过夜存放；
[0014]5)浸蜡
[0015]将透明后的茎段放置在60℃恒温箱中进行浸蜡处理，浸蜡过程全部使用纯蜡，期间要进行6次纯蜡的更换，间隔时间分别为4h、2h、2h、2h、2h、过夜；
[0016]6)包埋
[0017]将最终过夜浸蜡后的茎段在次日进行包埋处理，具体将茎段及石蜡一起倒入不锈钢包埋底模中，根据切片的需要用解剖针调整材料的位置，贴上塑料包埋盒，从塑料包埋盒上部再倒入一些熔好的石蜡，常温下冷却5min后置于冰上进行急速凝固，而后退掉不锈钢底模，得到与塑料包埋盒紧密连接的石蜡块；
[0018]7)切片、贴片及烤片
[0019]将包埋后的石蜡块修整整齐，用切片机切成8～12μm的薄片，并将薄片转移到载玻片上，将载玻片放置在40℃展片机上5min后，拿起载玻片竖放至多余的水分流掉，而后将载玻片放在40℃烘箱中干燥1d；
[0020]8)脱蜡
[0021]将烘干后的切片在100％二甲苯溶液中进行3次脱蜡处理，每次处理时间为3min，然后在100％二甲苯+100％乙醇溶液中过渡3min，后转移至100％乙醇溶液中进行两次处理，每次时间为3min，再换至95％乙醇溶液中浸泡3min；
[0022]9)染色
[0023]将脱蜡后的切片转移至5％间苯三酚+95％乙醇溶液处理3min，后用浓盐酸处理1min进行染色；
[0024]10)封片
[0025]将染色后的切片依次转移至95％乙醇溶液、100％乙醇溶液、100％二甲苯+100％乙醇溶液、100％二甲苯溶液、100％二甲苯溶液中各处理3min后进行封片处理，封片剂为100％二甲苯+中性树胶溶液，封片结束立即进行拍照观察处理。
[0026]优选的，在步骤1)中，所述FAA固定液为90ml 70％乙醇、5ml甲醛、5ml冰醋酸和5ml丙三醇的混合溶液。
[0027]优选的，所述步骤2)中的过氧化氢
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冰醋酸混合溶液、70％叔丁醇
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丙三醇混合溶液的溶液体积比均为1:1。
[0028]优选的，在步骤3)中用85％、95％、100％三个浓度梯度的乙醇进行脱水，85％和95％浓度的乙醇的脱水时间为2h，100％乙醇脱水两次，每次时间为1h。
[0029]优选的，在步骤4)中，所述100％二甲苯+无水乙醇溶液与100％二甲苯+石蜡溶液的溶液体积比均为1:1。
[0030]优选的，步骤7)中，在放置切片前，在载玻片上滴1滴甲液和2滴乙液并混合均匀，所述甲液组分为：1.5g明胶、5ml甘油、2g苯酚、100ml蒸馏水；乙液组分为：4ml甲醛、100ml蒸馏水。
[0031]优选的，在步骤8)中，100％二甲苯+100％乙醇溶液的溶液体积比均为1:1。
[0032]优选的，在步骤10)中，100％二甲苯+100％乙醇溶液的溶液体积比均为1:1、100％二甲苯+中性树胶溶液的溶液体积比均为1:2。
[0033]本专利技术的有益效果是：通过本专利技术的技术方案，能获得两年生马尾松茎干组织结构清晰完整、木质素沉积清晰易见的石蜡切片，并且通过该切片方法获得的石蜡切片，易于对两年生马尾松茎干组织结构及木质素沉积进行更好的观察，为探索生马尾松茎干的次生生长过程奠定基础。
附图说明
[0034]图1为本专利技术实施例的两年生马尾松茎干的组织结构切片。
[0035]图2为本专利技术观察图1切片木质素沉积的显微照片。
具体实施方式
[0036]为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和实施例对本专利技术的技术方案做进一步的描述。
[0037]参照附图1
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2所示的一种观察两年生马尾松茎干木质素沉积的切片制备方法，包括以下步骤：
[0038]1)取样及固定
[0039]取两年生马尾松茎底部5mm左右长茎段置于FAA固定液中，4℃冰箱固定48h以上；其中所述FAA固定液为90ml 70％乙醇、5ml甲醛、5ml冰醋酸和5ml丙三醇的混合溶液。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种观察两年生马尾松茎干木质素沉积的切片制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取样及固定取两年生马尾松茎底部5mm左右长茎段置于FAA固定液中，4℃冰箱固定48h以上；2)软化从FAA固定液中将茎段取出，用蒸馏水将茎段表面的固定液冲洗干净，然后将茎段置于过氧化氢
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冰醋酸混合溶液放置5h后，再转入装有70％叔丁醇
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丙三醇混合溶液中，并封闭置于50℃恒温箱中处理7d，每天更换一次70％叔丁醇
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丙三醇混合溶液；3)脱水将软化好的茎段用70％乙醇进行首次脱水，期间进行多次溶液的更换，每次在70％乙醇中脱水2h，之后置于4℃冰箱中过夜存放；次日用85
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100％浓度梯度递增的乙醇接着进行脱水；4)透明将脱水完后的茎段在100％二甲苯+无水乙醇溶液中过渡2h，过渡完成后在100％二甲苯溶液中透明两次，时间均为2h，透明结束后置于100％二甲苯+石蜡溶液中，在40℃恒温箱中进行过夜存放；5)浸蜡将透明后的茎段放置在60℃恒温箱中进行浸蜡处理，浸蜡过程全部使用纯蜡，期间要进行6次纯蜡的更换，间隔时间分别为4h、2h、2h、2h、2h、过夜；6)包埋将最终过夜浸蜡后的茎段在次日进行包埋处理，具体将茎段及石蜡一起倒入不锈钢包埋底模中，根据切片的需要用解剖针调整材料的位置，贴上塑料包埋盒，从塑料包埋盒上部再倒入一些熔好的石蜡，常温下冷却5min后置于冰上进行急速凝固，而后退掉不锈钢底模，得到与塑料包埋盒紧密连接的石蜡块；7)切片、贴片及烤片将包埋后的石蜡块修整整齐，用切片机切成8～12μm的薄片，并将薄片转移到载玻片上，将载玻片放置在40℃展片机上5min后，拿起载玻片竖放至多余的水分流掉，而后将载玻片放在40℃烘箱中干燥1d；8)脱蜡将烘干后的切片在100％二甲苯溶液中进行3次脱蜡处理，每次处理时间为3min，然后在100％二甲苯+100％乙醇溶液中过渡3min，后转移至100％乙醇溶液中进行两次处理，每次时间为3min，再换至95％乙醇溶液中浸泡3min；9)染色将脱蜡后的切片转移至5...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁贵杰，周紫晶，范付华，覃慧娟，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：