植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法和Leadmium技术

本发明专利技术涉及一种植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，包括：S1、先对Leadmium

【技术实现步骤摘要】
植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法和Leadmium
TM
Green AM新用途


[0001]本专利技术涉及植物细胞中金属元素的示踪方法，尤其是植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法和Leadmium
TM Green AM试剂的新用途。

技术介绍

[0002]目前，土壤铅、镉等重金属污染形式严峻。而利用植物对重金属的吸收和积累来修复铅、镉等重金属污染土壤，因其经济、环境友好，被当作理想的重金属污染土壤治理修复方法。近年来，大量研究致力于解析植物吸收、转运和积累铅、镉等重金属的机制。在植物中，铅和镉等重金属的吸收和转运经由两条途径：细胞内途径(共质体途径)和细胞外途径(质外体途径)。如何精确和特异的指示胞内和胞外的铅、镉等重金属离子一直是植物吸收转运重金属研究的热点和难点。
[0003]Leadmium
TM Green AM(铅离子/镉离子绿色荧光探针)是ThermoFisher Scientific旗下品牌Invitrogen的专利产品，是一种独特的工具用来高度特异性和高灵敏度的检测细胞内铅(lead,Pb)离子和镉(cadmium,Cd)离子水平。该指示剂中的AM(acetoxymethyl)基团一方面可以促进指示剂跨膜进入细胞内，另一方面能够阻止指示剂与铅、镉离子结合。当Leadmuim
TM Green AM进入细胞后，细胞质中的非特异性酯酶会水解掉AM基团，从而释放出带电荷的Leadmium
TM Green，其与细胞内的铅、镉离子易于结合，并在特定波长照射发出荧光，由此实现对细胞内铅、镉离子的示踪和检测。由此可见，Leadmium
TM Green AM试剂只能用于指示细胞内的铅、镉离子，而不能用于对细胞外(质外体)铅、镉离子的特异性指示。

技术实现思路

[0004](一)要解决的技术问题
[0005]鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法以及Leadmium
TM Green AM新用途。该方法主要是通过对Leadmium
TM Green AM进行改性处理，去除其所带的AM(acetoxymethyl)基团，使其不能进入细胞内并易于与细胞外的铅离子和/或镉离子结合产生荧光效应，借此用于对植物质外体中的铅离子和/或镉离子进行指示和示踪。
[0006](二)技术方案
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其包括：
[0009]S1、先对Leadmium
TM Green AM进行改性处理，去掉其连接的AM基团，得到不含AM基团的Leadmium
TM Green
‑
，并配成溶液；
[0010]S2、将植物组织与上述不含AM基团的Leadmium
TM Green
‑
溶液混合、避光孵育，孵育结束后，将植物组织取出，用适当波长的光照射植物组织，检测观察植物组织细胞外的荧光
AM溶液、Pre
‑
Leadmium溶液后，在荧光显微镜下观察的荧光情况。
具体实施方式
[0024]为了更好的解释本专利技术，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本专利技术作详细描述。
[0025]本专利技术使用酯酶体外水解掉Leadmuim
TM Green AM的AM基团，使该指示剂不能进入细胞内(共质体)，并且能够在体外结合铅、镉离子。预处理后的Leadmuim
TM Green
‑
，可应用于植物细胞外(质外体)铅离子和/或镉离子特异性示踪，开拓了Leadmuim
TM Green AM的新用途，解决了特异性指示细胞外(质外体)铅、镉离子的科学难题。
[0026]以下结合具体实施例，对本专利技术的方案和技术效果说明。
[0027]实施例1
[0028]本实施例采用生化方法(酯酶)体外水解掉Leadmuim
TM Green AM的AM基团。
[0029]试剂：Leadmuim
TM Green AM(A10024,Invitrogen,Paisley,UK)
[0030]DMSO(D2650,Sigma,St Louis,USA)
[0031]酯酶(46058,Sigma,St Louis,USA)
[0032]水解Leadmuim
TM Green AM的AM基团的方法为：
[0033](1)取50μg Leadmuim
TM Green AM粉末，加入10μL DMSO溶解，随后加入490μL去离子水，配成终浓度为100μg/mL的溶液。
[0034](2)将酯酶粉末用去离子水配成100U/mL的溶液。
[0035](3)取500μL Leadmuim
TM Green AM溶液，加入100μL酯酶，混匀，25℃避光反应30min。
[0036]此混合液为预处理后的Leadmuim
TM Green AM，命名为“Pre
‑
Leadmium”，以下“Pre
‑
Leadmium”均指该预处理后的Leadmuim
TM Green AM或记作Leadmuim
TM Green
‑
。
[0037]本专利技术的实施例采用生化方法(酯酶)体外水解AM基团对Leadmuim
TM Green AM进行改造，改造后的产物不残留任何对细胞有毒的因子。相比利用化学方法(如甲醇+氢氧化钾)，可避免使用化学试剂如甲醇或强碱等对植物细胞产生的毒害作用。同时，化学方法使用的有机溶剂(如甲醇)还会改变细胞膜通透性，导致细胞内和细胞外铅、镉离子分布发生改变。相对而言，酯酶广泛存在于在植物细胞内，外源酯酶对植物细胞活性和细胞膜的通透性几无影响。因此，本专利技术使用生化方法水解掉Leadmuim
TM Green AM的AM基团，对植物细胞干扰小，从而能够更加准确的指示植物质外体中的铅、镉离子。
[0038]实施例2
[0039]本实施例验证“Pre
‑
Leadmium”是否具有在细胞外结合铅离子并受激发光激发产生荧光的特性。
[0040]将实施例1制备的100μg/mL的Leadmuim
TM Green AM溶液、实施例1制备的“Pre
‑
Leadmium”和实施例1制备的100U/mL的酯酶分别取50μL滴加到载玻片上，随后，在载玻片上分别滴加20μL的硝酸铅溶液(50μmol/L)或氯化镉溶液(50μmol/L)。将载玻片室温避光反应5min，在荧光显微镜下观察荧光情况。
[0041]结果如图1所示，“LeadmiumTM Green AM+Pb/Cd”以及“酯酶+Pb/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其特征在于，包括：S1、先对Leadmium
TM Green AM进行改性处理，去掉其连接的AM基团，得到不含AM基团的Leadmium
TM Green
‑
，并配成溶液；S2、将植物组织与上述不含AM基团的Leadmium
TM Green
‑
溶液混合、避光孵育，孵育结束后，将植物组织取出，用适当波长的光照射植物组织，检测观察植物组织细胞外的荧光分布情况。2.根据权利要求1所述的植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其特征在于，S1的具体方法为：将Leadmium
TM Green AM粉末加入溶剂进行溶解和稀释，然后加入酯酶，混匀、25℃避光反应。3.根据权利要求1所述的植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其特征在于，S1的具体方法为：取一定量Leadmium
TM Green AM粉末，加入DMSO溶解，再加入去离子水定容，得到浓度为100μg/mL的Leadmium
TM Green AM溶液；将酯酶粉末用去离子水配成100U/mL的溶液；按体积比5：1将Leadmium
TM Green AM溶液与酯酶溶液混合均匀，25℃避光反应0.5
‑
1h，得到不含AM基团的Leadmium
TM Green
‑
溶液。4.根据权利要求1所述的植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其特征在于，S2中，所述适当波长为488nm。5.根据权利要求1所述的植物质外体铅离子和/或镉离子示踪方法，其特征在于，S2的具体方法为：先将植物组织浸泡在EDTA
‑
Na2溶液中1
‑
2min，取出用去离子水清洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：石文广，罗志斌，张玉红，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，
类型：发明
国别省市：