一种糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中的应用，所述糖酵解通路关键酶在IH增殖期组织与血管瘤内皮细胞中高表达，抑制关键酶磷酸果糖激酶

【技术实现步骤摘要】
endothelial cell,HemEC)生物学功能(比如抑制细胞增殖、促进凋亡等)，那么在临床上，就可以开发出针对这种酶的药物，阻断这种酶发生作用，进而下游所有的生物化学反应会中断或者受到抑制。目前临床上，针对PFKFB3的抑制剂PFK15已经用于黑色素一期临床试验中。在血管瘤中，如果糖酵解关键酶发挥重要作用，靶向抑制后，HemEC会凋亡，那么未来就可以着力于发展这种药物，将会给血管瘤的诊治带来新的方向。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述糖酵解通路关键酶在IH中的应用的糖酵解通路关键酶在IH中作用的鉴定方法，所述糖酵解通路关键酶在IH中作用的鉴定方法包括：
[0009]免疫组化分析IH增殖期组织与消退期组织中糖酵解关键酶的表达，在细胞水平采用western blot分析在HemEC与脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)的表达情况，并应用CCK8、Transwell与AnnexinV/PI法检测抑制剂干预PFKFB3表达后的HemEC的增殖、迁移及凋亡能力。
[0010]进一步，所述糖酵解通路关键酶在IH中作用的鉴定方法包括以下步骤：
[0011]步骤一，血管瘤增殖期与消退期组织进行免疫组化学处理；
[0012]步骤二，分别进行HemEC和HUVEC的分离与培养；
[0013]步骤三，进行Westernblot蛋白电泳以及细胞干预处理；
[0014]步骤四，分别进行CCK
‑
8以及Transwell检测；进行AnnexinV/PI双染以及数据统计学分析。
[0015]进一步，步骤一中，所述免疫组织化学处理，包括：
[0016]将手术切除的血管瘤组织标本迅速放入福尔马林中浸泡固定后，经石蜡组织包埋IH瘤体组织，用切片机制成4μm厚的切片，置入62℃烤箱中烤片过夜；第二天进行二甲苯脱蜡：将组织切片置于二甲苯中浸泡15min，更换二甲苯后在重复2次，每次均15min；随后进行梯度乙醇水化：无水乙醇浸泡10min、95％乙醇中浸泡10min以及80％乙醇浸泡10min；脱蜡与水化结束后，PBS洗涤3次，每次5min；随后进行抗原修复：将组织切片放入pH 6.0的枸橼酸中并置入微波炉高热加热2次，每次8min。
[0017]抗原修复完成后，继续PBS洗涤，5min/次，重复3次；3％的双氧水室温下封闭15min，PBS洗涤3次，每次5min；加入兔抗人Glut1(葡萄糖转运体1)、HK2(果糖激酶2)、PFKFB3、PFK1(磷酸果糖激酶1)、(丙酮酸激酶2)和LDHA(乳酸脱氢酶A)多克隆抗体，4℃冰箱过夜；第二天室温孵育二抗1h，PBS洗涤3次，每次5min，最后DAB显色2min，苏木精对比染色。
[0018]进一步，所述兔抗人Glut1、HK2、PFKFB3、PFK1、PKM2和LDHA多克隆抗体的体积稀释比例均为1：200。
[0019]进一步，步骤二中，所述进行HemEC和HUVEC的分离与培养，包括：
[0020](1)HemEC分离与培养
[0021]将手术切除的增殖期血管瘤组织标本放入装有EBM
‑
2培养基的50ml无菌离心管中，置于干冰中迅速转移至超净台，采用传统组织块消化法分离HemEC。
[0022](2)HUVEC的分离与培养
[0023]将新生儿脐带置于含有ECM培养基的50ml离心管中，于冰上迅速转移至超净台；挤除多余的血液，用无菌剪刀剪含有夹痕和血凝块的脐带段；寻找“腔大壁薄”的脐静脉，用50ml注射器吸取含双抗的PBS反复冲洗，将脐静脉内的血液排除干净；将脐静脉放入15cm的
培养皿中，用止血钳将脐静脉的一端夹紧，另一端用20ml注射器注入约10～15mlI型胶原酶，室温作用15～20min，期间可不时的轻柔脐带。
[0024]待胰酶消化作用时间结束后，将底端的止血钳打开，用15ml离心管收集从脐带中获得的消化液，同时用50ml注射器吸取PBS冲洗脐静脉并收集冲洗液；1500r/min离心5min，洗净上清；加入37℃预热的ECM培养基并吹打混匀制成细胞悬液；接种于明胶包被的6cm培养皿中，置于含5％CO2的37℃孵箱中继续培养24h后，更换新鲜培养基，每3天换液1次，直至细胞生长汇合。
[0025]进一步，步骤三中，所述进行Westernbolt以及细胞干预处理，包括：
[0026](1)Westernbolt
[0027]收集对数生长期的HemEC与HUVEC细胞置于冰上，吸去培养基，用提前预冷的PBS洗涤3次；加入适量预冷的RIPA裂解液于冰上裂解细胞15min；用细胞刮刮取培养皿中的细胞并收集到EP管内，超声继续裂解5s，重复2次；将EP管放入提前预冷的4℃离心机中，12000r，离心20min；离心结束后，小心吸取上清并转移至新的EP中，全程操作冰上进行。
[0028]用BCA法测定样品中的蛋白浓度，将所有蛋白样品调至等浓度；蛋白样品制成后进行SDS
‑
PAGE电泳，采用半干转法将SDS
‑
PAGE胶上蛋白转移到PVDF膜上，随后脱脂牛奶室温封闭1h，用糖酵解关键酶抗体进行一抗过夜孵育，第二天TBST洗膜后二抗孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min，加入ECL超敏发光液进行曝光显影。
[0029](2)细胞干预
[0030]将PFKFB3抑制剂PFK15溶于DMSO中制成20mM/L储存液并避光保存；所有试验均设立对照组，其中对照组含有1
‰
DMSO，不含PFK15；实验组药物干预时EBM
‑
2培养基中所含DMSO终浓度≤1
‰
。
[0031]进一步，步骤四中，所述CCK
‑
8和Transwell处理，包括：
[0032](1)CCK
‑8[0033]将处于对数生长期的HemEC用胰酶消化并制成单细胞悬液，按照8
×
103个/孔密度接种于96孔板中，每组设立4个副孔，每孔中加入100μl EBM
‑
2培养基；将96孔细胞培养板放在37℃、5％CO2孵箱中培养24h；第二天吸去培养液，用新鲜的含10％FBS的EBM
‑
2培养基稀释PFK15储存液成0、0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L及10μmol/L的工作浓度，每组分别加入含对应工作浓度的100ul培养基并继续培养24h后，吸除培养基，向每孔中加入110ul含CCK
‑
8的EBM
‑
2培养基；继续在培养箱中孵育，分别在加入CCK
‑
8后第0h、0.5h、1h、2h、3h与4h时用酶标仪测定在450nm处的吸光度；其中，所述CCK
‑
8与EBM
‑
2培养基的比例为1：10。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中的应用，其特征在于，所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤IH增殖期组织与血管瘤内皮细胞HemEC中高表达，抑制关键酶磷酸果糖激酶
‑
2/果糖
‑
2,6
‑
二磷酸酶3PFKFB3的活性可抑制HemEC的增殖与迁移，促进凋亡。2.一种应用如权利要求1所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中的应用的糖酵解通路关键酶在IH中作用的鉴定方法，其特征在于，所述糖酵解通路关键酶在IH中作用的鉴定方法包括以下步骤：免疫组化分析IH增殖期组织与消退期组织中糖酵解关键酶的表达，在细胞水平采用western blot分析在HemEC与脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)的表达情况，并应用CCK8、Transwell与Annexin V/PI法检测抑制剂干预PFKFB3表达后的HemEC的增殖、迁移及凋亡能力。3.如权利要求2所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中作用的鉴定方法，其特征在于，所述糖酵解通路关键酶在IH中作用的鉴定方法包括以下步骤：步骤一，血管瘤增殖期与消退期组织进行免疫组化学处理；步骤二，分别进行HemEC和HUVEC的分离与培养；步骤三，进行Westernblot蛋白电泳以及细胞干预处理；步骤四，分别进行CCK
‑
8以及Transwell检测；进行AnnexinV/PI双染以及数据统计学分析。4.如权利要求3所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中作用的鉴定方法，其特征在于，步骤一中，所述免疫组织化学处理包括：将手术切除的血管瘤组织标本迅速放入福尔马林中浸泡固定后，经石蜡组织包埋IH瘤体组织，用切片机制成4μm厚的切片，置入62℃烤箱中烤片过夜；第二天进行二甲苯脱蜡：将组织切片置于二甲苯中浸泡15min，更换二甲苯后在重复2次，每次均15min；随后进行梯度乙醇水化：无水乙醇浸泡10min、95％乙醇中浸泡10min以及80％乙醇浸泡10min；脱蜡与水化结束后，PBS洗涤3次，每次5min；随后进行抗原修复：将组织切片放入pH 6.0的枸橼酸中并置入微波炉高热加热2次，每次8min；抗原修复完成后，继续PBS洗涤，5min/次，重复3次；3％的双氧水室温下封闭15min，PBS洗涤3次，每次5min；加入兔抗人Glut1(葡萄糖转运体1)、HK2(果糖激酶2)、PFKFB3、PFK1(磷酸果糖激酶1)、(丙酮酸激酶2)和LDHA(乳酸脱氢酶A)多克隆抗体，4℃冰箱过夜；第二天室温孵育二抗1h，PBS洗涤3次，每次5min，最后DAB显色2min，苏木精对比染色。5.如权利要求4所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中作用的鉴定方法，其特征在于，所述兔抗人Glut1、HK2、PFKFB3、PFK1、PKM2和LDHA多克隆抗体的体积稀释比例均为1：200。6.如权利要求3所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中作用的鉴定方法，其特征在于，步骤二中所述进行HemEC和HUVEC的分离与培养包括：(1)HemEC分离与培养将手术切除的增殖期血管瘤组织标本放入装有EBM
‑
2培养基的50ml无菌离心管中，置于干冰中迅速转移至超净台，采用传统组织块消化法分离HemEC；(2)HUVEC的分离与培养将新生儿脐带置于含有ECM培养基的50ml离心管中，于冰上转移至超净台；挤除多余的
血液，用无菌剪刀剪含有夹痕和血凝块的脐带段；寻找“腔大壁薄”的脐静脉，用50ml注射器吸取含双抗的PBS反复冲洗，将脐静脉内的血液排除干净；将脐静脉放入15cm的培养皿中，用止血钳将脐静脉的一端夹紧，另一端用20ml注射器注入10～15ml I型胶原酶，室温作用15～20min，期间可不时的轻柔脐带；待胰酶消化作用时间结束后，将底端的止血钳打开，用15ml离心管收集从脐带中获得的消化液，同时用50ml注射器吸取PBS冲洗脐静脉并收集冲洗液；1500r/min离心5min，洗净上清；加入37℃预热的ECM培养基并吹打混匀制成细胞悬液；接种于明胶包被的6cm培养皿中，置于含5％CO2的37℃孵箱中继续培养24h后，更换新鲜培养基，每3天换液1次，直至细胞生长汇合。7.如权利要求3所述糖酵解通路关键酶在婴幼儿血管瘤中作用的鉴定方法，其特征在于，步骤三中所述进行Western bolt以及细胞干预处理包括：(1)Western bolt收集对数生长期的HemEC与HUVEC细胞置于冰上，吸...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉毅，杨开颖，邱桐，张学鹏，周江元，陈思源，龚雪，兰钰茹，张赓，张梓欣，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：