一种高效去除新生牛血清内毒素的方法技术

本发明专利技术提供了一种高效去除新生牛血清内毒素的方法，属于生物制药技术领域。本发明专利技术结合硅藻土和聚己内酯纳米颗粒，分步吸附内毒素超标的新生牛血清，通过低温离心，取离心上清液，弃吸附沉淀，可获得内毒素合格的新生牛血清。本发明专利技术提供的高效去除新生牛血清内毒素的方法能够将新生牛血清中内毒素含量从100EU/ml～500EU/ml有效的降低至5EU/ml～10EU/ml，并且，利用本发明专利技术方法去除内毒素后，不会影响新生牛血清中有效成分的活性，适合细胞培养及疫苗生产应用。疫苗生产应用。

【技术实现步骤摘要】
一种高效去除新生牛血清内毒素的方法


[0001]本专利技术属于生物制药
，尤其涉及一种高效去除新生牛血清内毒素的方法。

技术介绍

[0002]内毒素是革兰氏阴性菌生长时释放或死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖类物质，细菌死亡时会释放内毒素，不同的细菌中内毒素的化学组成有一定的差别，但是都包含脂质A。内毒素分布广泛，且具有毒性，每个大肠杆菌约含有200万个内毒素分子，污染了内毒素的生物制品在使用时会影响实验结果或造成结果失真。
[0003]内毒素分子化学性质非常稳定，在水溶液聚合成不同分子量的聚合物，且血清中污染的内毒素难以去除。在细胞培养过程中使用的血清中污染了内毒素会对细胞造成不良影响，例如可以改变细胞的外形，降低肝细胞对六碳糖的吸收能力；可活化巨噬细胞使其分泌肿瘤坏死因子，产生不可预测级联效应；可促进或抑制细胞分裂；由于内毒素对不同细胞株产生的影响不同，且与内毒素的来源有关，因此科研人员为了获得稳定可信的实验结果，应使用去除内毒素的胎牛血清培养细胞。
[0004]目前在新生牛采血过程中容易受到细菌污染，而污染后的细菌在血清中释放内毒素，容易造成血清中内毒素含量超标。目前，控制新生牛牛血清中内毒素含量的方法主要为：提升采血场所洁净度；减少采血过程中细菌污染情况发生；非特异性物理吸附、离子交换，亲和吸附、免疫吸附等方式来去除血清中的内毒素，降低内毒素含量。
[0005]通过改进采血场所洁净度虽是从源头上解决细菌内毒素污染的问题，但是不能完全杜绝污染的情况，一旦发生污染，没有有效的内毒素去除方法就会造成本批次血清的浪费，或者造成不同批次间污染程度差别较大等问题，而非特异性物理吸附、离子交换，亲和吸附以及免疫吸附等去除血清内毒素的方式，会导致血清中的蛋白、细胞因子等活性成分的丢失，不利于细胞培养。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在提供一种高效去除新生牛血清内毒素的方法，目的在于获得内毒素含量合格的新生牛血清，并且，本方法的使用不会影响新生牛血清中有效成分的活性，适合细胞培养及疫苗生产应用。
[0007]根据本专利技术具体实施方式提供的一种高效去除新生牛血清内毒素的方法，内毒素含量合格的新生牛血清由含有以下步骤的方法制备而成：
[0008]S1：首先，把新生牛血清放置在反应容器中；
[0009]S2：将医用级，并且内毒素含量小于2.5EU/g的硅藻土加入S1的所述新生牛血清中，所述硅藻土应按所述新生牛血清重量的2.0～5.0％进行添加，并于2
‑
8℃低温环境下吸附内毒素16～24h后，再在
‑
4℃、离心力8000g
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10000g条件下离心10
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20min，取上清液；
[0010]S3：将S2中所得上清液通过0.45μm滤膜过滤，取滤液；
[0011]S4：然后在S3所得滤液中加入聚己内酯纳米颗粒(粒径为495nm～1000nm)，所述聚己内酯纳米颗粒的添加量为每1000kg所述新生牛血清中不小于1.5kg，于2
‑
8℃低温条件下，静态吸附血清中残余内毒素8
‑
12h，待吸附完成后，在
‑
4℃、离心力8000g
‑
10000g条件下离心10
‑
20min，收集所述聚己内酯纳米颗粒用0.5M NaOH处理再生利用，取离心液。
[0012]S5：将S4中所得离心液经过0.22μm滤膜、0.1μm滤膜分级过滤，该滤液即为内毒素检测合格的新生牛血清。
[0013]本专利技术结合硅藻土和聚己内酯纳米颗粒，分步吸附内毒素超标的新生牛血清，通过低温离心，取离心上清液，弃吸附沉淀，可获得内毒素合格的新生牛血清。本专利技术提供的高效去除新生牛血清内毒素的方法能够将新生牛血清中内毒素含量从100EU/ml～500EU/ml有效的降低至5EU/ml～10EU/ml，并且，利用本专利技术方法去除内毒素后，不会影响新生牛血清中有效成分的活性，适合细胞培养及疫苗生产应用。
[0014]另外，根据本专利技术实施例的高效去除新生牛血清内毒素的方法还具有如下附加的技术特征：
[0015]根据本申请的一些实施例，所述新生牛血清为冷冻后解冻血清，并且，所述新生牛血清的解冻方法为在35℃～37℃恒温条件下快速解冻。
[0016]根据本申请的一些实施例，所述硅藻土的添加量为所述新生牛血清重量的3.0～4.0％。
[0017]根据本申请的一些实施例，所述硅藻土需用内毒素合格的超纯水浸泡、清洗后，用2
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3倍体积的0.1
‑
0.3M NaCl
‑
PB缓冲液(pH6.5
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7.5)浸泡平衡12～16h。
[0018]根据本申请的一些实施例，所述聚己内酯纳米颗粒的添加量为每1000kg所述新生牛血清中添加1.5～5kg。
[0019]根据本申请的一些实施例，所述聚己内酯纳米颗粒需用适合生理条件要求的缓冲溶液(pH 2.8～9.6)浸泡、清洗、平衡。
[0020]根据本申请的一些实施例，所述缓冲溶液可以是柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris缓冲液中的任意一种。
[0021]根据本申请的一些实施例，所述聚己内酯纳米颗粒浸泡、清洗、平衡的方法为：将一定量的所述聚己内酯纳米颗粒用2
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3倍体积的所述缓冲溶液浸泡15～30min，抽滤、干燥；重复上述操作3～5次后，再将聚己内酯纳米颗粒浸泡于1
‑
2倍体积的所述缓冲溶液中，备用。
[0022]本专利技术的有益效果：
[0023]本专利技术中所选硅藻土、聚己内酯纳米颗粒基本无毒或低毒，内毒素吸附后无毒性物质残留；本专利技术所选硅藻土、聚己内酯纳米颗粒内毒素吸附效率高，硅藻土成本低、聚己内酯纳米颗粒可再生利用，故所得新生牛血清成本低、经济效益高。
[0024]本专利技术中血清解冻方法为在35℃～37℃恒温条件下快速解冻，保证了血清中有效成分的生物活性。
[0025]经过本专利技术方法去除内毒素后的新生牛血清中蛋白质、细胞因子、活性多肽、氨基酸、激素等生物活性物质与初始提供的新生牛血清基本无差异。
[0026]因此，本专利技术所得新生牛血清可应用于细胞培养研究中，也可应用于生物疫苗规模生产中。
具体实施方式
[0027]为使本专利技术实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。
[0028]实施例1
[0029]本专利技术提供的新生牛血清去除内毒素的方法，其中新生牛血清内毒素含量为500EU/mL～550EU/mL，包括如下步骤：
[0030]S1：内毒素吸附剂预处理：
[0031本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效去除新生牛血清内毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：首先，把新生牛血清放置在反应容器中；S2：将医用级，并且内毒素含量小于2.5EU/g的硅藻土加入S1的所述新生牛血清中，所述硅藻土应按所述新生牛血清重量的2.0～5.0％进行添加，并于2
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8℃低温环境下吸附内毒素16～24h后，再在
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4℃、离心力8000g
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10000g条件下离心10
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20min，取上清液；S3：将S2中所得上清液通过0.45μm滤膜过滤，取滤液；S4：然后在S3所得滤液中加入聚己内酯纳米颗粒(粒径为495nm～1000nm)，所述聚己内酯纳米颗粒的添加量为每1000kg所述新生牛血清中不小于1.5kg，于2
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8℃低温条件下，静态吸附血清中残余内毒素8
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12h，待吸附完成后，在
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4℃、离心力8000g
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10000g条件下离心10
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20min，收集所述聚己内酯纳米颗粒用0.5M NaOH处理再生利用，取离心液。S5：将S4中所得离心液经过0.22μm滤膜、0.1μm滤膜分级过滤，该滤液即为内毒素检测合格的新生牛血清。2.根据权利要求1所述的高效去除新生牛血清内毒素的方法，其特征在于，所述新生牛...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓未，王艳茹，付改玲，刘永清，石慧，刘厚霞，杨晶，
申请(专利权)人：呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司，
类型：发明
国别省市：