一种菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种菜豆金色花叶病毒属RPA

【技术实现步骤摘要】
一种菜豆金色花叶病毒属RPA
‑
LFD检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种菜豆金色花叶病毒属RPA
‑
LFD检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]菜豆金色花叶病毒属的病毒粒子为双联体结构，无包膜，由两个不完整的二十面体组成。是有效的免疫源。该属病毒在寄主植物中的分布局限于韧皮部及相邻的薄壁细胞，病毒侵染后细胞核呈现明显的病理变化，核膨大并形成颗粒状结构和纤维状结构，纤维状物质可浓缩成各种大小的环。现有的技术菜豆金色花叶病毒属检测都是单个病毒的RPA
‑
LFD的检测，不能针对多种病毒进行检测，因此，提出一种菜豆金色花叶病毒属RPA
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LFD检测试剂盒及其应用。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种菜豆金色花叶病毒属RPA
‑
LFD检测试剂盒及其应用。
[0004]本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：
[0005]本专利技术提供了一种菜豆金色花叶病毒属RPA
‑
LFD检测试剂盒，包含如下引物组和核酸检测试纸条：
[0006]所述的引物组的核苷酸序列如下所示：
[0007]FITC
‑
Beg
‑
310R：FITC
‑
TGTGTGAGTCCGGTTCCTCGTGTAACATC，
[0008]RPA
‑
Beg
‑
64F：AACTTCGACAGCCCATATGTTTCCCGTG；
[0009]探针Bio
‑
Beg
‑
Probe：
[0010]Biotin
‑
GACAAACAGGCCGATGAACAGAAAACCAAAG(THF)ATGTACAGGATGTA
‑
PHO。
[0011]进一步改进在于，所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。
[0012]本专利技术还提供了一种上述的菜豆金色花叶病毒属RPA
‑
LFD检测试剂盒在检测菜豆金色花叶病毒属中的应用。
[0013]进一步改进在于，所述菜豆金色花叶病毒属包括中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)。
[0014]进一步改进在于，RPA反应试剂包括以下成分：BufferA：50mMTris(pH7.9)，100mM醋酸钾，2mMDTT，5％Carbowax20M，200μMdNTPs，3mMATP，50mM磷酸肌酸，100ng/μl肌酸激酶，30ng/μlBsu；10μM上游引物，10μM下游引物，探针，ddH2O；14mM醋酸镁。
[0015]进一步改进在于，除醋酸镁外，预先将上述试剂混合制成预混液，该预混液比例为BufferA29.5μl，上游引物2.1μl，下游引物3μl，探针0.6μl，ddH2O11.3μl，待进行试验时再加入1
‑
2μl模板和2.5μl醋酸镁，反应即可开始。
[0016]进一步改进在于，包含以下步骤：
[0017](1)对待测样本提取植物基因组DNA或者直接提取待测样本的破碎种子或汁液作
为模板，采用预混液对待测样本进行重组酶聚合酶扩增，反应条件为39℃、18min，由此得到带有修饰标记的扩增产物；
[0018](2)将待测样品进行RPA反应后的扩增产物用无菌水稀释20倍后，将侧流层析试纸条插入该反应液中，待3
‑
5min后观察。
[0019](3)结果判读：
[0020]若试纸条上显示两条带，上面条带代表控制线，下面条带代表检测线，表明该样本含有中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)四种病毒；
[0021]若试纸条上只显示出一条控制线条带，表明该样本不含有中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)四种病毒。
[0022]本专利技术提具有如下有益效果：
[0023]本专利技术提供了一种菜豆金色花叶病毒属RPA
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LFD检测试剂盒，本专利技术引物和探针适用于菜豆金色花叶病毒属，能够有效且特异的检测该属四种病毒的外壳蛋白片段，可以高效灵敏的检测菜豆金色花叶病毒属的4种病毒，同时本专利技术将RPA所需试剂按照一定比例混合，应用此配比下的试验反应可以高效灵敏的检测菜豆金色花叶病毒属的中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)四种病毒。
附图说明
[0024]图1为中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)的RPA恒温扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
[0025]图2为菜豆金色花叶病毒属RPA
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LFD检测试剂盒检测阴阳性对照图；
[0026]图3为菜豆金色花叶病毒属RPA
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LFD检测试剂盒检测假阳性图。
具体实施方式
[0027]下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
[0028]1、材料
[0029]本专利技术所用方法如无特别说明均为本领域技术人员所知晓的常规方法，所用试剂等，如无特别说明，均为市售购买产品。
[0030]2、方法
[0031]2.1引物及探针序列的设计
[0032]根据菜豆金色花叶病毒属病毒外壳蛋白基因序列的保守区和RPA引物设计原则，针对该区域设计了引物和探针，RPA对引物长度的要求是30
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35bp，扩增产物在500bp之内，扩增效率较高，要建立一种快速、敏感的检测方法，需要进行多次引物的筛选，引物个别碱基差异会对扩增效果产生影响，所以，在保守基因区域，设计一系列梯度候选物，再根据RT
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RPA凝胶检测的结果，从中选择最佳引物。应用引物设计软件PrimePremier5.0进行RPA引物
设计，同时应用生物软件Oligo7.0对引物进行筛选，以确保各引物对之间产生的二聚体较少为原则。
[0033]本专利技术合成的引物组的核苷酸序列如下所示：
[0034]FITC
‑
Beg
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310R：FITC
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TGTGTGAGTCCGGTTCCTCGTGTAACATC，
[0035]RPA
‑
Beg
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菜豆金色花叶病毒属RPA
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LFD检测试剂盒，其特征在于，包含如下引物组和RPA
‑
LFD检测试纸条：所述的引物组的核苷酸序列如下所示：FITC
‑
Beg
‑
310R：FITC
‑
TGTGTGAGTCCGGTTCCTCGTGTAACATC，RPA
‑
Beg
‑
64F：AACTTCGACAGCCCATATGTTTCCCGTG；探针Bio
‑
Beg
‑
Probe：Biotin
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GACAAACAGGCCGATGAACAGAAAACCAAAG(THF)ATGTACAGGATGTA
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PHO。2.根据权利要求1所述的一种菜豆金色花叶病毒属RPA
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LFD检测试剂盒，其特征在于，所述的核酸检测试纸条为通用型RPA
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LFD核酸检测试纸条。3.一种如权利要求1
‑
2任一所述的菜豆金色花叶病毒属RPA
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LFD检测试剂盒在检测菜豆金色花叶病毒属中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菜豆金色花叶病毒属包括中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，RPA反应试...

【专利技术属性】
技术研发人员：王芳，严丹侃，陈莹，韩科雷，马超，胡淑珍，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，
类型：发明
国别省市：