一种鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法技术

本发明专利技术适用于生物技术领域，提供了一种鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法，1）将鹿茸根部骨化组织通过风味蛋白酶（来源于米曲霉）进行酶解反应，获得的酶解产物进行冷冻干燥处理；2）对步骤1）中所述酶解产物进行分离纯化处理，获得具有较高钙结合能力的肽；3）将上述肽与钙离子进行螯合反应，获得肽螯合钙产物；经鉴定本发明专利技术获得的肽具有较高的钙结合能力，与钙离子结合后制备的所述肽螯合钙产物具有晶体结构。有晶体结构。有晶体结构。

【技术实现步骤摘要】
一种鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法。

技术介绍

[0002]肽螯合钙是一种以蛋白质水解得到的小分子肽为原料，将其与钙离子结合得到的营养强化剂。小分子肽可以直接作为钙离子跨膜运输的载体，具有耗能低、运输速度快、载体不易饱和等优点。
[0003]目前，现有的肽螯合钙多来源于食源性蛋白质水解产物，例如酪蛋白磷酸肽、乳清蛋白肽、大豆蛋白肽、小麦胚芽蛋白肽和猪骨蛋白肽等。不同来源的肽可以为人体提供必需氨基酸，更好保持人体内氨基酸平衡，不会对人体产生负面影响。
[0004]本专利技术的目的在于以鹿茸根部骨化组织酶解多肽为原料，提供一种鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法，从而获得钙结合能力较高的三种肽，证明其能够与钙离子发生螯合反应，形成所述肽螯合钙产物。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法，旨在提供一种鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法。
[0006]对于原材料的使用，也可选用含有生物活性成分的鹿骨、鹿肉、鹿托盘和鹿胎盘等；本专利技术采用鹿茸根部骨化组织作为原料，通过酶解、羟基磷灰石层析、凝胶过滤层析和反相高效液相层析色谱分离纯化得到肽，经LC
‑
MS/MS鉴定，其序列分别为TKLGTQLQL(TL9)、LETVILGLLKT(LT11)和KMVFLMDLLK(KK10)，此三种肽具有良好的钙结合活性，形成的肽螯合钙产物具有一定的晶体结构。
[0007]本专利技术是这样实现的，一种鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法，包括以下步骤：
[0008]1)将鹿茸根部骨化组织通过风味蛋白酶(来源于米曲霉)进行酶解反应，获得的酶解产物进行冷冻干燥处理；
[0009]2)对步骤1)中所述酶解产物进行分离纯化处理，获得具有较高钙结合能力的肽；
[0010]3)将上述肽与钙离子进行螯合反应，获得肽螯合钙产物。
[0011]进一步的技术方案，所述步骤1)中的酶解反应中：酶解时间为4
‑
6h；酶解温度为40
‑
60℃；pH值为7.5
‑
9.5；底物浓度为2
‑
10％；风味蛋白酶(来源于米曲霉)用量为6000
‑
8000u/g；得到的酶解产物先在
‑
20℃的温度条件下预冻10
‑
12h，之后在
‑
80℃的温度条件下预冻10
‑
12h，最后在1
‑
10Pa的气压条件下冷冻干燥至完全干燥状态后保存。
[0012]进一步的技术方案，在步骤2)中，利用羟基磷灰石层析色谱法对酶解产物进行纯化，在此过程中：控制流速为1.8
‑
2.0ml/min，洗脱液浓度选取200
‑
400mM磷酸盐缓冲液，收集器时间间隔设置为2min，依次收集各出峰组分，在215nm处检测波长，收集其中钙结合活
性最高的组分进行下一步纯化。
[0013]进一步的技术方案，在步骤2)中，利用凝胶过滤色谱法对通过羟基磷灰石层析色谱法分离后的酶解产物的组分进行进一步分离，在此过程中：控制流速为0.3
‑
0.5ml/min，洗脱液为去离子水，收集器时间间隔设置为4min，收集各出峰组分，在215nm处检测波长，收集其中钙结合活性最高的组分进行下一步纯化。
[0014]进一步的技术方案，在步骤2)中，利用反相高效液相色谱法对利用凝胶过滤色谱法层析后的组分进一步分离，在此过程中：控制流速为0.8
‑
1.0ml/min，其中流动相为：A液为去离子水(含0.05％三氟乙酸)，B液为乙腈(含0.05％三氟乙酸)；洗脱梯度为0
‑
25％B，洗脱时间为20min，收集各出峰组分，在215nm处检测波长，收集其中钙结合活性最高的组分进行肽序列鉴定。
[0015]进一步的技术方案，在步骤3)中，所述钙离子来自于无水氯化钙；所述螯合反应中，肽和无水氯化钙的质量比为4:1
‑
6:1；螯合反应的温度为45
‑
55℃；螯合反应pH值为7.0
‑
8.0；螯合反应时间为50
‑
70min。
[0016]进一步的技术方案，利用反相高效液相色谱法分离出的肽TL9、LT11和KK10，经LC
‑
MS/MS鉴定，其序列分别为TKLGTQLQL、LETVILGLLKT和KMVFLMDLLK；经数据库比对，其分别来源于toll样受体3短型、膜联蛋白A2和DNA解旋酶ERCC6L；其钙结合能力分别为87.68
±
2.86％、80.72
±
0.93％和67.97
±
0.98％。
[0017]进一步的技术方案，将所述螯合反应后的产物加入一定体积的无水乙醇中，之后低温冷藏一段时间，待肽与钙离子形成絮状沉淀后，在6200rpm、4℃的条件下离心分离，弃上清获得沉淀物，即为所述肽螯合钙产物。
[0018]相较于现有技术，本专利技术的有益效果如下：
[0019](1)本专利技术提供的一种鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法，采用的原料取自鹿茸根部骨化部位，该部位骨化严重，属于鹿茸中品质不佳的部位，但其生长速度可达1.7cm/day，是唯一可以再生的哺乳动物器官，这些都决定了其与钙螯合的肽或蛋白质含量丰富，是优质的钙螯合肽来源。
[0020](2)本专利技术提供的一种鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法，获得肽TL9、LT11和KK10，其序列被鉴定为TKLGTQLQL、LETVILGLLKT和KMVFLMDLLK，其钙结合能力分别为87.68
±
2.86％、80.72
±
0.93％和67.97
±
0.98％；其中TL9和LT11的钙结合能力高于现有分离技术获得的猪骨胶原肽的钙结合能力。
[0021](3)经序列鉴定，本专利技术获得的肽为首次发现并具有较高的钙结合能力；本专利技术获得的肽能够作为钙离子的载体，与钙离子发生螯合反应，制备成所述肽螯合钙产物。
附图说明
[0022]图1、图2为本专利技术中通过羟基磷灰石层析法分离后收集到的不同组分以及其与钙结合能力图。
[0023]图3、图4为本专利技术中通过凝胶过滤色谱法分离后收集到的不同组分以及其与钙结合能力图。
[0024]图5、图6为本专利技术中通过反相高效液相色谱法分离后收集到的不同组分以及其与钙结合能力图。
[0025]图7、图8、图9、图10为本专利技术中利用LC
‑
MS/MS鉴定的三种肽序列及其与钙结合能力图。
[0026]图11为本专利技术中肽TL9与钙离子结合前、后的红外光谱图。
[0027]图12为本专利技术中肽LT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将鹿茸根部骨化组织通过风味蛋白酶（来源于米曲霉）进行酶解反应，获得的酶解产物再进行冷冻干燥处理；2）对步骤1）中所述酶解产物进行分离纯化处理，获得具有较高钙结合能力的肽；3）将上述肽与钙离子进行螯合反应，获得肽螯合钙产物。2.根据权利要求1所述的鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中的酶解反应中：酶解时间为4
‑
6h；酶解温度为40
‑
60℃；pH值为7.5
‑
9.5；底物浓度为2
‑
10%；风味蛋白酶（来源于米曲霉）用量为6000
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8000u/g；得到的酶解产物先在
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20℃的温度条件下预冻12h，之后在
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80℃的温度条件下预冻12h，最后在1
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10Pa的气压条件下冷冻干燥至完全干燥状态后保存。3.根据权利要求1所述的鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，利用羟基磷灰石层析色谱法对酶解产物进行纯化，在此过程中：控制流速为1.8
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2.0ml/min，洗脱液浓度选取200
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400mM磷酸盐缓冲液，收集器时间间隔设置为2min，收集各出峰组分，在215nm处检测波长，收集其中钙结合活性最高的组分进行下一步纯化。4.根据权利要求3所述的鹿茸根部骨化组织源肽螯合钙的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，利用凝胶过滤色谱法对通过羟基磷灰石层析...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝林琳，翟晓瑞，夏培钧，程淑琴，郑硕，李素娥，桂宝玉，
申请(专利权)人：长春市双阳区博文鹿业良种繁育有限公司，
类型：发明
国别省市：