一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及其在抑制短小芽孢杆菌中的应用技术

本发明专利技术提供一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及其在抑制短小芽孢杆菌中的应用；所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物为通过底盘宿主细胞异源表达细菌素基因簇所得；所述细菌素基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明专利技术耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法，能够快速获得细菌素并能提高细菌素产量，且成本低廉，经验证该细菌素类似物对短小芽孢杆菌生长具有明显的抑制作用，可用于防治由短小芽孢杆菌引起的病害。用于防治由短小芽孢杆菌引起的病害。用于防治由短小芽孢杆菌引起的病害。

【技术实现步骤摘要】
一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及其在抑制短小芽孢杆菌中的应用


[0001]本专利技术涉及微生物合成生物学
，特别涉及一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及其在抑制短小芽孢杆菌中的应用。

技术介绍

[0002]1.抗病代谢途径的标准化与模块化设计
[0003]随着耐药菌株的不断增加，目前迫切需要寻找绿色安全的抗生素替代品，而微生物可产生多种多样具生物活性的天然次级代谢产物，将在医疗、农业和食品等领域有着广阔的应用前景，有望作为新药产生的主要来源之一。但目前存在某些次级代谢产物的生物合成基因簇处于沉默状态，产物不易制备以及产量低等问题。
[0004]合成生物的应运而生将有助于解决以上难题。合成生物学是在系统生物学的研究基础上，引入工程学原理和方法，从头构建具有可预测行为的人工生物装置和系统，包括计算模型和模块化DNA，通过标准的设计和模块组件间的相互连接从而建立代谢途径并构建生物回路来控制细胞行为。因此基于系统生物学与合成生物学的微生物底盘细胞的设计与开发，可实现优良细胞工厂的构建与改造。目前，科学家已开发出异源表达合成生物学平台，而大肠杆菌因有完善的遗传工具箱，已被认为是高效的异源宿主，通过异源表达途径重建与基因工程相结合，从而达到发现新化合物，阐明产物合成途径，优化产品产量的目的。
[0005]2.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)
[0006]短小芽孢杆菌可产生多种具抗菌活性的代谢产物包括表面活性素，丰霉素，杆菌素D和几丁质酶，具有生物防治及促生功能，是一种良好的生物防治剂。但近年来发现，短小芽孢杆菌不仅可作为生防菌，还可引起人类各种感染，包括血液感染，皮肤感染，食物中毒，新生儿败血症，心内膜炎等。万古霉素治疗被认为是芽孢杆菌感染的首选药物，同时可使用青霉素，β
‑
内酰胺抗生素，头孢曲松等抗生素治疗短小芽孢杆菌感染，但对克林霉素具有抗性。
[0007]3.细菌素(Bacteriocin)
[0008]细菌素是细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的蛋白或多肽。细菌素具有分子量小、易被蛋白酶降解而无残留，对人体无毒副作用等优点，目前可用于食品防腐、人类疾病防治和生物防治等。细菌素的合成通常需要多个模块相互作用。
[0009]4.耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)
[0010]在我们此前的工作中分离获得一株耐硼赖氨酸芽孢杆菌，并对其进行研究，研究发现，该菌株及其发酵液对于槟榔根腐病菌、水稻纹枯病菌、稻瘟病菌等病菌均具有良好的抑菌活性(参见专利文献CN111100806A、CN111100805A、CN111187726A)，但对于耐硼赖氨酸芽孢杆菌在抑制短小芽孢杆菌方面、其细菌素基因以及合成生物学方面的研究尚未涉及。

技术实现思路

[0011]鉴以此，本专利技术提出一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及其在抑制短小芽孢杆菌中的应用。
[0012]本专利技术以实验室保存的一株可拮抗多种病原细菌和病原真菌的潜在拮抗生防菌耐硼赖氨酸芽孢杆菌为研究对象，对其基因组进行分析，挖掘细菌素基因簇，再以大肠杆菌为底盘宿主细胞，通过异源表达细菌素基因簇，使用合成生物学针对特定目标重新设计系统的方法，最终生产出具有生物学活性的细菌素抗菌活性物质。
[0013]优选的，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO.M 2019773。
[0014]本专利技术的技术方案主要包括以下内容：
[0015]本专利技术提供一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物在抑制短小芽孢杆菌中的应用。
[0016]优选的，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物为通过底盘宿主细胞异源表达细菌素基因簇所得，该基因簇的核苷酸序列如如SEQ ID NO.1所示。
[0017]优选的，所述抑制为抑制短小芽孢杆菌的生长。
[0018]一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法，包括以下步骤：
[0019]1)耐硼赖氨酸芽孢杆菌基因组DNA：采用过夜培养的耐硼赖氨酸芽孢杆菌菌液提取基因组DNA；
[0020]2)基因簇的PCR扩增：以步骤1)提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增结束后，对PCR产物进行纯化回收，得目的基因簇DNA片段；
[0021]3)质粒的双酶切及凝胶回收：用限制性内切酶对质粒进行双酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切下含目的载体的凝胶，纯化，得克隆载体；
[0022]4)无缝克隆连接：使用无缝克隆连接的方法连接步骤2)的目的基因簇DNA片段和步骤3)的克隆载体，得重组质粒；
[0023]5)转化：将步骤4)的重组质粒转化底盘宿主细胞，转化结束后，筛选含有重组质粒的细胞；
[0024]6)培养：将步骤5)筛选出的细胞进行培养，得发酵液，提取发酵液，得细菌素类似物。
[0025]优选的，所述PCR扩增的引物为Bac(10)
‑
F和Bac(10)
‑
R。
[0026]优选的，所述Bac(10)
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0027]优选的，所述Bac(10)
‑
R的核苷酸序列SEQ ID NO.3所示。
[0028]优选的，所述PCR扩增的扩增体系为50μL，包括：2
×
PCR mix 25μL、模板1μL、Bac(10)
‑
R(10μmol/L)1μL、Bac(10)
‑
F(10μmol/L)1μL、余量为ddH2O。
[0029]优选的，所述PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，Tm
‑
5℃退火30s，72℃延伸，根据目的条带大小，按照1kb/min计算延伸时间，循环30次；72℃延伸10min；4℃。
[0030]优选的，所述限制性内切酶为BamHI和EcoRI。
[0031]优选的，所述双酶切的体系为30μL，包括：质粒XμL，限制性内切酶A 1μL，限制性内切酶B1μL，10
×
Cutsmartbuffer 3μL，余量为ddH2O。
[0032]优选的，所述转化为电击转化法。
[0033]优选的，所述电击转化法，具体包括以下步骤：将感受态细胞置于冰上使其溶解，加入步骤4)的重组质粒，吹打混匀，得菌液，然后将菌液转移到已灭菌预冷后的电转杯中，进行电击转化，转化结束后加入LB液体培养基，复苏，离心，收集菌体，弃上清，加入LB液体培养基，悬浮菌体，涂布到壮观霉素抗性平板上，在37℃培养12
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16h。
[0034]优选的，所述复苏为在37℃、150rpm复苏1h本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物在抑制短小芽孢杆菌中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物在抑制短小芽孢杆菌生长方面的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物为通过底盘宿主细胞异源表达细菌素基因簇所得。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因簇的核苷酸序列如如SEQ ID NO.1所示。5.根据权利要求1至4任一项所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取耐硼赖氨酸芽孢杆菌基因组DNA；2)基因簇的PCR扩增：以步骤1)提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增结束后，对PCR产物进行纯化回收，得目的基因簇DNA片段；3)质粒的双酶切及凝胶回收：用限制性内切酶对质粒进行双酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切下含目的载体的凝胶，纯化，得克隆载体；4)无缝克隆连接：使用无缝克隆连接的方法连接步骤2)的目的基因簇DNA片段和步骤3)的克隆载体，得重组质粒；5)转化：将步骤4)的重组质粒转化底盘...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏，刘柱，唐燕琼，陈银华，马香，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：