具有微/纳复合拓扑结构的可注射多孔微球的制备方法技术

本发明专利技术属于骨缺损治疗领域，具体涉及一种具有微/纳复合拓扑结构的可注射多孔微球的制备方法。首先公开了一种多巴胺（PDA）自聚修饰的多孔微球，其制备方法包括：将左旋聚乳酸（PLLA）初级多孔微球置于预制的PDA的Tris

【技术实现步骤摘要】
具有微/纳复合拓扑结构的可注射多孔微球的制备方法


[0001]本专利技术属于骨缺损治疗领域，更具体地说，具体涉及一种具有微/纳复合拓扑结构的可注射多孔微球的制备方法。

技术介绍

目前临床针对骨缺损已具备较完善治疗策略，主要包括积极的断端复位、丰富的自体/异体骨移植以及坚强的内/外固定。但是，仍有5
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10%患者出现骨不愈合或延迟愈合，主要是因为现有的治疗很大程度上忽略了骨免疫微环境在骨愈合过程中的重要作用。骨免疫微环境主要受两种免疫反应影响。一种是急性机械损伤时血管破裂，血小板被激活，多种凝血因子、细胞因子及趋化因子释放，多种类型细胞受募集迁移至损伤部位，促成骨组织修复的初始自体炎症阶段。另一种是血肿机化的慢性期抗炎表型上调，免疫细胞与血管内皮细胞（HUVEC）、间充质干细胞（MSC）之间交互作用，调节血管成熟以及骨组织细胞外基质重塑。然而，免疫微环境虽然有着炎症损伤向抗炎修复的自发转化倾向，但是严重损伤、高龄或者合并有其他基础疾病，亦或是骨折引起过度炎症免疫应答，常导致严重免疫微环境紊乱，表现为异常的炎症病理性修复，造成骨不愈合。在难治性骨缺损的需求驱使下，骨移生物一直被作为协调损伤与再生、炎症与修复的研究热点，而重编程免疫修复微环境在免疫介导的组织修复程序中有着巨大潜力。因此，如何设计骨移植生物材料将“被动惰性固定形式”转变为
ꢀ“
主动重编程骨免疫微环境模式”是亟待突破的瓶颈。
[0002]在骨愈合过程中，免疫微环境程序性的炎症损伤
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抗炎修复的激活过程。其中，关键介质是作为免疫应答第一道防线的多相巨噬细胞（Mφ）响应局部免疫微环境中的信号，从经典激活途径的促炎型 M1向选择性激活途径的抗炎型 M2 亚型转换。在这一系列过程中，巨噬细胞不同生物亚型发挥着独特的作用，其旁分泌的多种细胞介质或衍生信号几乎持续存在，在骨免疫微环境病理走向中发挥承接性决定作用。Spiller等的研究认为在血管网发芽、吻合和成熟过程中，M1 巨噬细胞分泌引发血管生成过程的因子（如血管内皮生长因子VEGF）；而M2巨噬细胞则通过分泌PDGF
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BB、MMP9在血管融合和重构中发挥重要作用。此外，MSC作为主要参与骨再生种子细胞，受M2型巨噬细胞旁分泌途径调节，激活转化生长因子
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β1（TGF
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β1）、骨形态发生蛋白（BMP）等多条信号通路，靶向上调 Runx2、Osterix 成骨基因，促进MSC成骨分化。但是，因为自身疾病或者植入材料免疫应答炎症风暴导致的紊乱免疫微环境，很大程度影响M1向M2的自发转化，导致急性炎症发展为慢性炎症，抑制血管成熟，甚至破坏血管萌芽，最终导致病理性纤维化斑痕，损害骨折愈合。这些研究证明，程序性激活巨噬细胞，通过旁分泌作用重编程骨免疫微环境，建立Mφ与HUVEC、MSC良性交互关系，增强血管萌芽成熟以及骨组织再生，无疑将为治疗骨缺损打开新视野。但是，针对大段骨缺损患者，如何赋予填充的骨移植材料重编程免疫微环境功能，仍值得深入探索。
[0003]目前国内外的研究主要通过在材料中整合抗炎药物或者生物制剂去直接调控巨噬细胞的表型以调节机体自身或者材料植入后的免疫应答。例如，有研究者在CaSiO3
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β
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TCP 支架上结合了IFN
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γ，通过IFN
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γ和Si的释放来调节巨噬细胞的M2极化，但是在局部
存在一定弥散分布不均、有效浓度不足等问题，同时生物制剂难以预料的副作用也是限制其应用的重要原因。另一方面，由于缺乏与细胞外微环境相匹配的多尺度纤维拓扑结构使其很难作为一种微环境支架提供合适的结构性支持。专利技术人课题组以往的骨膜研究中，发现胶原在PLLA电纺丝膜内部自组装构建等级性仿生骨膜纤维层，形成的微/纳结构，极大的模拟了骨细胞外基质纤维结构。更重要的是，胶原存在RGD和GFOGER序列配体，能够与巨噬细胞表面整合素受体结合，激活STAT6信号通路促进M2亚型极化。但是，虽然充分模拟软骨内成骨与膜内成骨的天然骨修复进程，仿生骨膜材料植入过程也可能造成二次损伤等缺陷，不适用于当下的微侵入性理念。可注射微球是一种具有广阔转化应用前景的术式，不仅操作简便、精准，而且适宜的粒径、高度的孔隙率也为组织局部运输代谢产物和输送营养物质提供便利。高分子聚合物微球与胶原自组装更增大比表面积，充分暴露巨噬细胞、间充质干细胞识别配体，有利于增强细胞的生物学作用。此外，在骨膜研究过程中，我们发现，PLLA虽然含有一些功能基团（如
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COOH），对胶原有一定的亲合力，但是两者之间的接枝力较弱，无法充分模拟骨组织细胞外基质的机械性能。因此，如何实现微球等级微/纳结构的整合，通过拓扑结构调控Mφ功能亚型，重编程骨免疫微环境，可能是突破治疗骨缺损困境的新策略。
[0004]
技术实现思路

[0005]为了解决上述现有技术存在的困境，本专利技术的目的在于提供一种微/纳复合拓扑结构的可注射多孔微球。本专利技术利用乳液微流控技术制备PLLA初级多孔微球。针对PLLA功能基团较少，对胶原亲合力弱，但是两者之间的接枝力较差的缺点，通过多巴胺自聚涂层形成两者之间的共价和非共价的双重连接进行整合，构建了以微/纳复合拓扑结构为特征的可注射多孔微球。通过一系列材料学测试、细胞实验及动物体内实验证明了微/纳复合拓扑结构的可注射多孔微球具有良好的生物相容性、一方面其可以通过3D微/纳复合结构为组织修复细胞提供更多的生长空间供给。另一方面其激活了整合素（integrin）介导的M2Mφ极化与旁分泌机制进行免疫微环境的重编程，营造适宜内皮细胞和干细胞细胞活动的微环境，实现骨缺损快速而均匀的修复。
[0006]为了实现上述目的，具体的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术第一个方面公开了一种多巴胺自聚修饰的多孔微球，其制备方法包括：将左旋聚乳酸初级多孔微球置于预先配置好的PDA的Tris
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HCl 缓冲液中进行多巴胺自聚修饰，得到多巴胺自聚修饰的多孔微球。
[0007]优选的，其制备方法包括：S1、制备微流控乳液；S2、通过微流控装置制备左旋聚乳酸初级多孔微球；S3、将左旋聚乳酸初级多孔微球置于预先配置好的PDA的Tris
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HCl 缓冲液中进行多巴胺自聚修饰，在常温下过夜进行反应，得到多巴胺自聚修饰的多孔微球。
[0008]应当理解，本专利技术中多巴胺自聚修饰的多孔微球的制备方法并不限于上述步骤，在S1之前、S1和S2之间、S2和S3之间、S3之后还可以包括其他额外的步骤，且均在本专利技术的保护范围之内。
[0009]在本专利技术的一些具体实施例中，PDA的Tris
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HCl缓冲液的浓度配比为：10nM Tris
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HCL，pH=8.5，PDA 2mg/ml。优选的，所述S2包括：S21：搭建微流控装置，使用一同轴针头制备微球，末端连接收集管，置于收集容器中；S22：将S1制备得到的微流控乳液作为非连本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多巴胺自聚修饰的多孔微球，其特征在于，其制备方法包括：将左旋聚乳酸初级多孔微球置于预先配置好的PDA的Tris
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HCl 缓冲液中进行多巴胺自聚修饰，得到多巴胺自聚修饰的多孔微球。2.根据权利要求1所述的多巴胺自聚修饰的多孔微球，其特征在于，其制备方法包括：S1、制备微流控乳液；S2、通过微流控装置制备左旋聚乳酸初级多孔微球；S3、将左旋聚乳酸初级多孔微球置于预先配置好的PDA的Tris
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HCl 缓冲液中进行多巴胺自聚修饰，在常温下过夜进行反应，得到多巴胺自聚修饰的多孔微球。3.根据权利要求2所述的多巴胺自聚修饰的多孔微球，其特征在于，所述S2包括：S21：搭建微流控装置，使用一同轴针头制备微球，末端连接收集管，置于收集容器中；S22：将S1制备得到的微流控乳液作为非连续相，与装置的内针管相连；将PVA溶液作为连续相，与装置的外针管相连；S23：将微球收集于冰水浴中的容器内，低速搅拌过夜以充分挥发二氯甲烷；S24：将微球置于温水浴中搅拌2
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5h，期间用去离子水清洗后冻干保存，即得到左旋聚乳酸初级多孔微球。4.一种微/纳复合拓扑结构的可注射多孔微球，其特征在于，根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，顾勇，吴亮，崔文国，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：