一种基于微流控芯片定点定量检测癌症标记物的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片定点定量检测癌症标记物的方法，PDMS通道由两个入口之后分叉形成六个浓度梯度待检测物质的通道组成，其中为了混合均匀采用了“S”型的曲线通道，为了减少直角带来的死体积，连接处采用圆弧；微流控芯片由PDMS和玻璃键合而成，PDMS上有微米级通道，试剂成本大大降低，集成化程度高，具有自动化批量生产，便携式检测的潜力；微流控通道氨基的修饰采用PDMS刷子印刷的方法，其中将刷子设计为不等间距，方便定点修饰对比观察；生物素修饰的适配体可以和链霉亲和素连接，其上的荧光亮度可以反应连接的适配体浓度，随着荧光被BHQ荧光淬灭剂猝灭，之后加入与适配体结合的待检测物质，根据荧光强度的恢复程度来判断待检测物质的浓度，实现一个“亮

【技术实现步骤摘要】
一种基于微流控芯片定点定量检测癌症标记物的方法


[0001]本专利技术属于癌症标记物检测领域，尤其涉及一种新型微流控芯片以及对芯片进行层层修饰，并使用修饰芯片利用荧光强度去定点定量检测多种癌症标记物，实现多种癌症标记物联合检测的方法。

技术介绍

[0002]血清CA125、HE4和CEA水平与上皮性卵巢癌的发生发展密切相关，联合检测CA125、HE4和CEA对上皮性卵巢癌的早期诊断、疾病发展监测和预后评估具有重要意义
[1]。在临床实验中，癌症标记物水平通常通过放射测量
[2]和酶免疫测定
[3]来测量。这些传统的分析非常耗时，并且需要配备特殊设备的实验室。近几十年来，已经开发了几种检测癌症标记物的方法，包括表面等离子共振
[4]、电化学
[5,6]、比色法
[7]。微流控技术能够轻松地将分析实验室搬到某个或某些微型分析设备上，该技术借助于微机电加工技术手段，利用微米级通道实现结构微型化和网络化。其主要优点包括微型化、低成本、高效率
[8]。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供一种基于微流控芯片定点定量检测癌症标记物的方法，解决现有技术中传统的检测癌症标记物的方法分析耗时、精度不高的问题。
[0004]本专利技术的技术方案是：
[0005]一种微流控检测芯片，由PDMS通道和硼硅玻璃片键合而成，所述PDMS 通道主要分成两条，一条通PBS溶液，一条通样本溶液，通道设置为斜线和曲线的结合，其中为了溶液在通道中充分混合修饰，显色曲线通道设计成三个弯的逶迤曲线通道，之后分三级稀释，最后形成六个浓度梯度应用于检测。
[0006]微流控检测芯片的制备方法，超声后干净的硼硅玻璃片、PDMS刷子以及 PDMS通道等离子清洗进行羟基修饰，之后用PDMS刷子蘸取带有氨基的硅烷化试剂对硼硅玻璃片进行定点修饰，将PDMS通道和硼硅玻璃片按压键合，制备了氨基修饰的微流控检测芯片。
[0007]所述PDMS刷子为用于定点修饰的PDMS刷子，刷条宽度从400μm到50 μm，依次递减50μm，形成宽度不等依次递减的8个刷条。
[0008]微流控芯片修饰适配体检测癌症标记物的方法，包括以下步骤：
[0009](1)利用机械注射泵向微流控芯片通入链霉亲和素溶液修饰芯片；继续向芯片中修饰BSA封闭通道，减少表面的非特异性吸附；之后通入DNA适配体链溶液，其一端是由荧光标记物标记的，一端是连接生物素的发卡DNA结构，为方便检测，保证荧光染料发光颜色不同，在显微镜下观察，通道发出不同颜色的荧光；
[0010](2)利用机械注射泵给步骤(1)修饰后的微流控芯片通入BHQ溶液，在显微镜下观察，多种荧光颜色的通道均变暗；
[0011](3)向通道的两个入口通入溶液，上端通入PBS溶液，下端通入癌症标记物标准品溶液，根据PBS溶液体积的不同形成待检测物质的浓度梯度，在显微镜下观察，通道对应荧
光颜色变亮，得到癌症标记物标准品浓度与荧光强度的拟合曲线，癌症标记物标准品浓度越高荧光强度越高；
[0012](4)将得到的拟合曲线应用于血清样本，对其中几种癌症标记物的浓度进行联合分析。
[0013]本专利技术提出一端是荧光染料一端是生物素的发卡结构适配体。生物素的一端可以和链霉亲和素结合固定使其固定在芯片通道上，荧光染料的一端在特定激发波长的光波下可以观察到特定颜色。BHQ作为一种荧光猝灭剂，由于能和适配体其中一段序列结合，使得其和荧光染料距离很近，在10nm以内，芯片通道里的特定颜色消失。待检测物质的加入会打开DNA链适配体的发卡结构，使得荧光染料与BHQ的距离变远，芯片通道里的特定颜色恢复。随着待检测物质浓度越高，芯片通道颜色恢复越明显，根据不同浓度待测物质所恢复的荧光亮度，拟合曲线，由此可以实现对于该物质的定量检测。
[0014]本专利技术提出了用不等间距的PDMS刷子蘸取APTES来修饰通道，为之后链霉亲和素的结合提供氨基，形成固定结合位点，刷条宽度从400μm到50μm，依次递减50μm，形成宽度不等依次递减的8个刷条，不等间距的宽度可以方便观察，形成对比。
[0015]本专利技术的有益效果是：
[0016]1、本专利技术首次设计了一种新型的PDMS通道，利用逶迤通道使溶液在通道中分散并且充分与通道的化学键结合，并且有两个通道进口，可以稀释待检测溶液，形成浓度梯度。本专利技术首次利用一种新型的PDMS刷子实现对适配体的定点修饰。
[0017]2、本专利技术利用链霉亲和素与生物素连接的DNA链相结合，链霉亲和素与生物素具有稳定的连接性质，并且有四个连接位点，可以结合更多的适配体，具有放大信号的效果。由于适配体的稳定性，在通道中可以修饰多种适配体，互不干扰，并且不同癌症标志物检测链用不同荧光标记，可以根据不同颜色的光实现多种标记物的同时检测。
[0018]3、本专利技术应用微流控通道可以大大节约溶液用量，利用荧光强度来评价癌症标记物浓度，由于光学信号拥有极其稳定性质，因此在实际应用中具有极大优势。首先，加入被荧光标记的适配体使得通道变亮，接着加入荧光猝灭剂使得通道变暗，之后加入待检测物质，其浓度可以被荧光亮度直观表现出来，实现一个“亮
‑
灭
‑
亮”的检测，并且根据荧光强度的数值，可以量化待检测物质的浓度。
[0019]本专利技术微流控芯片应用于血清样本中癌症标记物的检测，可以大大降低样品消耗，同时满足检测精度，并且实现多种癌症标记物联合检测。
附图说明
[0020]图1是PDMS通道俯视图；
[0021]图2是PDMS刷子3D图；
[0022]图3是微流控芯片定点修饰实现癌症标记物检测的示意图；
[0023]图4是通道修饰荧光标记适配体的4倍显微镜荧光图；
[0024]图5是通道修饰荧光标记适配体的40倍显微镜荧光图；
[0025]图6是通道修饰荧光猝灭剂的4倍显微镜荧光图；
[0026]图7是加入不同浓度的待检测标准品的4倍显微镜荧光图；
[0027]图8是通道待检测溶液浓度分布示意图，颜色越深代表浓度越高；
[0028]其中，图1中(1)是PDMS的进样通道口1，(2)是PDMS的进样通道口 2，(3)是PDMS的出样通道口；图3中(4)是羟基化后的通道表面，(5)是定点修饰氨基后的通道表面，(6)是氨基结合链霉亲和素之后的通道表面，(7) 是通道结合一端为生物素一端为荧光标记物的适配体表面，(8)是加入荧光猝灭剂之后的通道表面，(9)是通入待检测物质之后的通道表面；图7中(10) 是加入20U/mL CA125通道的显微镜荧光图，(11)是加入270U/mL CA125通道的显微镜荧光图。
具体实施方式
[0029]以下结合附图及具体实施例对本专利技术作详细描述，但并不是限制本专利技术。
[0030]本专利技术提供的一种微流控芯片应用于血清样本中卵巢癌标记物CA125的检测方法，可以根据检测血清中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微流控检测芯片，其特征在于，由PDMS通道和硼硅玻璃片键合而成，所述PDMS通道主要分成两条，一条通PBS溶液，一条通样本溶液，通道设置为斜线和曲线的结合，其中为了溶液在通道中充分混合修饰，显色曲线通道设计成三个弯的逶迤曲线通道，之后分三级稀释，最后形成六个浓度梯度应用于检测。2.权利要求1的微流控检测芯片的制备方法，其特征在于，超声后干净的硼硅玻璃片、PDMS刷子以及PDMS通道等离子清洗进行羟基修饰，之后用PDMS刷子蘸取带有氨基的硅烷化试剂对硼硅玻璃片进行定点修饰，将PDMS通道和硼硅玻璃片按压键合，制备了氨基修饰的微流控检测芯片。3.根据权利要求2所述的微流控检测芯片的制备方法，其特征在于，所述PDMS刷子为用于定点修饰的PDMS刷子，刷条宽度从400μm到50μm，依次递减50μm，形成宽度不等依次递减的8个刷条。4.权利要求1所述的微流控芯片修饰适配体检...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡畅，谭硕，李爽，兰颖，明东，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：