一种双顺反子病毒的扩繁方法技术

本发明专利技术提供一种双顺反子病毒的扩繁方法，属于害虫生物防治技术领域，该双顺反子病毒的扩繁方法，包括如下步骤：S1、毒源病毒的制备：S11、将多个单头蠋蝽样品分别转移至装有液氮预冷的多个研钵中，并将单头蠋蝽样品研磨成粉末状；本发明专利技术中利用携带蠋蝽病毒的过滤液，将其注入不同的鳞翅目害虫体内，通过试验数据得知，上述鳞翅目害虫经注射后体内携带病毒率可达100%，且通过不同时期病毒扩增曲线可以看出该病毒能够有效在鳞翅目害虫体内进行扩繁，并导致寄主昆虫取食减少、活动力下降、羽化率降低，表明其能够有效感染农业害虫，对农业害虫有自然控制作用，在农业生产发展行业有广阔的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种双顺反子病毒的扩繁方法


[0001]本专利技术属于害虫生物防治
，具体涉及一种双顺反子病毒的扩繁方法。

技术介绍

[0002]化学农药的长期不合理使用，造成作物农药残留超标、害虫产生抗药性和环境污染等问题，正日益受到人们的重视，也已成为世界上公认的、亟待解决的问题。昆虫病原微生物具有对靶标害虫专一、不伤害天敌和环境友好等优点，对调节多种农林业昆虫种群至关重要，是害虫综合治理的重要组成部分。
[0003]因此，亟需一种能够抑制农业和养殖业的病毒，利用病毒的寄主专一性等特征，应用在生物防治，使其成为防治节肢动物的潜在天敌，是业内待解决的问题，所以，我们提供一种双顺反子病毒的扩繁方法，利用病毒感染农业害虫，对农业害虫有自然控制作用，使得农业害虫种群数量下降，有利于农业生产发展。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种双顺反子病毒的扩繁方法，旨在解决现有技术中的化学农药的长期不合理使用，造成作物农药残留超标、害虫产生抗药性和环境污染的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种双顺反子病毒的扩繁方法，包括如下步骤：S1、毒源病毒的制备：S11、将多个单头蠋蝽样品分别转移至装有液氮预冷的多个研钵中，并将单头蠋蝽样品研磨成粉末状，每个研钵中各取0.1g样品粉末装入离心管中，并分别加入TRIzol
™ꢀ
Reagent混匀，待用；S12、然后对各个离心管中的混匀液进行提取RNA，并进行反转录和PCR扩增后检测样本带毒情况；再将带毒单头蠋蝽样品剩余粉末混合，加入1
×
PBS，颠倒混匀，离心后吸取上清；S13、此时通过滤膜过滤得到病毒过滤液，并将过滤液暂存于冷藏箱内存储，待用；S2、人工接种病毒：S21、取5龄第1天的草地贪夜蛾；S22、通过显微注射的方式将病毒注入草地贪夜蛾体内，首先将进样针进行消毒、晾干和清洗，然后吸取步骤S13中的病毒过滤液，注入草地贪夜蛾体内；S3、病毒的采收：将接种病毒后的草地贪夜蛾放置于在培养箱中饲养，待其化蛹即可。
[0006]作为本专利技术一种优选的方案，所述步骤S11中通过研杵对单头蠋蝽样品进行充分研磨。
[0007]作为本专利技术一种优选的方案，所述步骤S11中离心管采用1.5ml无菌无酶离心管。
[0008]作为本专利技术一种优选的方案，所述步骤S12中提取的RNA经反转录和PCR扩增处理
后，经凝胶电泳检测样本带毒情况。
[0009]作为本专利技术一种优选的方案，所述步骤S12中通过在4℃ 6000 rpm的状态下离心15分钟。
[0010]作为本专利技术一种优选的方案，所述步骤S13中的过滤时采用0.2μM的滤膜。
[0011]作为本专利技术一种优选的方案，所述步骤S13中冷藏箱的冷藏温度为
‑
80℃。
[0012]作为本专利技术一种优选的方案，所述步骤S13过滤液中病毒拷贝数为7.57
×
10
11
copies/μL。
[0013]作为本专利技术一种优选的方案，所述步骤S22中进样针使用经0.2μM滤膜过滤的1
×
PBS进行清洗。
[0014]作为本专利技术一种优选的方案，所述步骤S3中接种病毒后的草地贪夜蛾在27℃培养箱中饲养至化蛹。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术中利用携带蠋蝽病毒（Arma chinensis virus
‑
1，AcV
‑
1）的过滤液，将其注入多个草地贪夜蛾体内，通过试验得知，多个草地贪夜蛾体内携带病毒率为100%，且通过不同时期病毒扩增曲线可以看出该病毒能够有效在鳞翅目害虫体内进行扩繁，并导致寄主昆虫取食减少、活动力下降、羽化率降低，表明其能够有效感染农业害虫，对农业害虫有自然控制作用，不仅使的农业害虫种群数量下降，而且一对生态环境造成破坏，在农业生产发展行业有广阔的应用前景。
附图说明
[0016]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为本专利技术中AcV
‑
1定量标准曲线图；图2为本专利技术中AcV
‑
1粒子在草地贪夜蛾体内水平变化规律图；图3为本专利技术中稀释10倍后AcV
‑
1粒子在草地贪夜蛾体内水平变化规律图；图4为本专利技术中AcV
‑
1通过注射在鳞翅目害虫种群中水平传播方式检测电泳图；图5为本专利技术中的流程框图。
具体实施方式
[0017]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0018]实施例1请参阅图1
‑
5，本专利技术提供以下技术方案：一种双顺反子病毒的扩繁方法，包括如下步骤：S1、毒源病毒的制备：S11、将多个单头蠋蝽样品分别转移至装有液氮预冷的多个研钵中，并用研杵充分研磨单头蠋蝽样品组织直至研磨成粉末状，每个研钵中各取0.1g样品粉末装入1.5 mL无菌
无酶离心管中，并分别加入TRIzol
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Reagent混匀，待用；S12、然后对各个离心管中的混匀液进行提取RNA，并进行反转录和PCR扩增后通过凝胶电泳检测样本带毒情况；再将带毒单头蠋蝽样品剩余的粉末进行混合，并加入1
×
PBS，颠倒混匀，在4℃ 6000 rpm的条件下离心15分钟，吸取上清；S13、此时通过0.2μM滤膜过滤得到病毒过滤液，得到的过滤液中病毒拷贝数为7.57
×
10
11 copies/μL，暂存于
‑
80℃ 以备使用；S2、人工接种病毒：S21、取5龄第1天的草地贪夜蛾多头；S22、通过显微注射的方式将病毒注入草地贪夜蛾体内，首先将进样针进行消毒、晾干和清洗，然后吸取步骤S13中的病毒过滤液，注射量为8
‑
10 μL，沿草地贪夜蛾身体长度平行方向，从倒数第二腹节的节间膜处，由后往前刺穿草地贪夜蛾体壁，将病毒过滤液注射进草地贪夜蛾体内；S3、病毒的采收：将接种病毒后的草地贪夜蛾放置于在27℃培养箱中饲养，待其化蛹即可。
[0019]进一步的，显微注射使用Hamilton 700系列MICROLITER进样针705 N，先用无水乙醇对进样针进行消毒，晾干后，使用经0. 2 μM滤膜过滤的1
×
PBS对进样针进行清洗，再用进样针吸取AcV
‑
1过滤液。
[0020]如图1所示，本专利技术还提供AcV
‑
1定量标准曲线的试验：（1）根据病毒序列，利用Primer Premier 5.0软件设计合成荧光定量PCR引物和TaqMan探针；（2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双顺反子病毒的扩繁方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、毒源病毒的制备：S11、多个单头蠋蝽样品分别转移至装有液氮预冷的多个研钵中，并将单头蠋蝽样品研磨成粉末状，每个研钵中各取0.1g样品粉末装入离心管中，并分别加入TRIzol
™ꢀ
Reagent混匀，待用；S12、然后对各个离心管中的混匀液进行提取RNA，并进行反转录和PCR扩增后检测样本带毒情况；再将带毒单头蠋蝽样品剩余粉末混合，加入1
×
PBS，颠倒混匀，离心后吸取上清；S13、此时通过滤膜过滤得到病毒过滤液，并将过滤液暂存于冷藏箱内存储，待用；S2、人工接种病毒：S21、取5龄第1天的草地贪夜蛾；S22、通过显微注射的方式将病毒注入草地贪夜蛾体内，首先将进样针进行消毒、晾干和清洗，然后吸取步骤S13中的病毒过滤液，注入草地贪夜蛾体内；S3、病毒的采收：将接种病毒后的草地贪夜蛾放置于在培养箱中饲养，待其化蛹即可。2.根据权利要求1所述的一种双顺反子病毒的扩繁方法，其特征在于，所述步骤S11中通过研杵对单头蠋蝽样品进行充分研磨。3.根据权利要求2所述的一种双顺反子病毒的扩繁方法，其特征在于，所述步骤S11中离心管采用...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐蓬军，孙梅雪，任广伟，王秀芳，王新伟，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所中国烟草总公司青州烟草研究所，
类型：发明
国别省市：