包括人源化凝血因子12基因座的非人动物制造技术

提供了包括人源化凝血因子XII(F12)基因座的非人动物基因组、非人动物细胞和非人动物以及制备和使用此类非人动物基因组、非人动物细胞和非人动物的方法。包括人源化F12基因座的非人动物细胞或非人动物表达人凝血因子XII蛋白或嵌合凝血因子XII蛋白，所述嵌合凝血因子XII蛋白的片段来自人凝血因子XII。提供了用于使用包括人源化F12基因座的此类非人动物来评估如被设计成靶向人F12的核酸酶试剂等靶向人凝血因子XII的试剂的体内功效的方法。还提供了在脑中局部产生的F12的短同种型以及使用所述短同种型的方法。所述短同种型的方法。所述短同种型的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包括人源化凝血因子12基因座的非人动物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年4月4日提交的美国申请第62/829,321号的权益，所述美国申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
[0003]通过EFS WEB以文本文件形式提交的序列表
[0004]写入文件545986SEQLIST.txt中的序列表为121千字节，创建于2020年3月22日，并且特此通过引用并入。

技术介绍

[0005]凝血因子连同血小板是血管损伤期间的止血过程中相关的血液组分。众所周知，当调节(即，产生和/或活动)中出现不平衡时，这些组分可能是血栓形成的驱动因素。血栓性疾病被认为主要由外在途径(通过组织因子)的异常活化引起，但最近对F12缺陷型小鼠和靶向活化凝血因子XII(因子XIIa)的分子进行的临床前研究表明，内在凝血途径(也称为接触途径)也有所涉及。因子XIIa是接触途径的核心，并且可以通过因子XI的切割来驱动凝血，或者可以通过血浆前激肽释放酶的切割来驱动炎症。因此，对因子XII活性的抑制可能导致与接触途径活化相关的血栓性凝血和炎症减少。
[0006]然而，仍然需要合适的非人动物提供靶向人凝血因子XII的试剂的真实人靶标或真实人靶标的近似靶标，由此能够在活体动物中测试此类药剂的功效和作用模式以及药代动力学和药效学研究。

技术实现思路

[0007]提供了包括人源化凝血因子XII(F12)基因座的非人动物以及制备和使用此类非人动物的方法。还提供了包括人源化凝血因子XII(F12)基因座的非人动物基因组或细胞以及制备和使用此类非人动物基因组或细胞的方法。还提供了人源化非人动物F12基因、核酸酶试剂和/或用于使非人动物F12基因人源化的靶向载体以及制备和使用此类人源化F12基因的方法。
[0008]一方面，提供了包括人源化凝血因子XII(F12)基因座的非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物。此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物可以在其基因组中包括人源化内源F12基因座，在所述基因座中，内源F12基因座的区段已被缺失并替换为对应的人F12序列。
[0009]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，人源化内源F12基因座对包括人凝血因子XII重链的蛋白质进行编码。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，人源化内源F12基因座对包括人凝血因子XII轻链的蛋白质进行编码。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，人源化内源F12基因座对包括人凝血因子XII信号肽的蛋白质进行编码。
[0010]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，包括编码序列和非编码序列两者的内源F12基因座的区域已被缺失并替换为包括编码序列和非编码序列两者的
对应的人F12序列。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，人源化内源F12基因座包括内源F12启动子，其中人F12序列可操作地连接到内源F12启动子。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，内源F12基因座的至少一个内含子和至少一个外显子已被缺失并替换为对应的人F12序列。
[0011]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，内源F12基因座的整个F12编码序列已被缺失并替换为对应的人F12序列。任选地，内源F12基因座从起始密码子到终止密码子的区域已被缺失并替换为对应的人F12序列。
[0012]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，内源F12 3'非翻译区尚未被缺失并且尚未替换为对应的人F12序列。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，内源F12 5'非翻译区尚未被缺失并且尚未替换为对应的人F12序列。
[0013]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，内源F12基因座从起始密码子到终止密码子的区域已被缺失并替换为对应的人F12序列，并且内源F12启动子尚未被缺失并且尚未替换为对应的人F12序列。
[0014]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，人源化内源F12基因座处的人F12序列包括与SEQ ID NO:31或32中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，人源化内源F12基因座对蛋白质进行编码，所述蛋白质包括与SEQ ID NO:5或46中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，人源化内源F12基因座包括编码序列，所述编码序列包括与SEQ ID NO:13或48中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，人源化内源F12基因座包括与SEQ ID NO:17或18中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
[0015]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，人源化内源F12基因座不包括选择盒或报告基因。在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，人源化内源F12基因座包括位于对应的人F12序列的内含子内的选择盒或报告基因。
[0016]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，非人动物对于人源化内源F12基因座是纯合的。
[0017]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，非人动物包括其种系中的人源化内源F12基因座。
[0018]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，非人动物是哺乳动物。任选地，非人动物是大鼠或小鼠。任选地，非人动物是小鼠。
[0019]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，非人动物在脑中表达短人凝血因子XII同种型。任选地，短人凝血因子XII同种型由F12 mRNA进行编码，所述F12mRNA由针对人F12的外显子11
‑
14的探针检测，但不由针对人F12的外显子1
‑
6的探针检测。任选地，短人凝血因子XII同种型是FXII
297
‑
596
。任选地，短人凝血因子XII同种型在脑的神经元中表达。任选地，短人凝血因子XII同种型可以由血浆激肽释放酶活化，并将pro
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HGF转化为活性HGF。
[0020]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，非人动物具有与对应的野生型非人动物中的活化部分凝血活酶时间(aPTT)无显著差异的aPTT，和/或其中非人
动物具有与对应的野生型非人动物中的前凝血酶时间(PT)无显著差异的PT。
[0021]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，非人具有至少约5μg/mL的人凝血因子XII血浆水平。
[0022]在一些此类非人动物基因组、非人动物细胞或非人动物中，内源F12基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种非人动物，其基因组中包括人源化内源F12基因座，在所述基因座中，内源F12基因座的区段已被缺失并替换为对应的人F12序列。2.根据权利要求1所述的非人动物，其中所述人源化内源F12基因座对包括人凝血因子XII重链的蛋白质进行编码。3.根据权利要求1或2所述的非人动物，其中所述人源化内源F12基因座对包括人凝血因子XII轻链的蛋白质进行编码。4.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述人源化内源F12基因座对包括人凝血因子XII信号肽的蛋白质进行编码。5.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中包括编码序列和非编码序列两者的内源F12基因座的区域已被缺失并替换为包括编码序列和非编码序列两者的对应的人F12序列。6.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述人源化内源F12基因座包括内源F12启动子，其中所述人F12序列可操作地连接到内源F12启动子。7.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中内源F12基因座的至少一个内含子和至少一个外显子已被缺失并替换为所述对应的人F12序列。8.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中内源F12基因座的整个F12编码序列已被缺失并替换为所述对应的人F12序列。9.根据权利要求8所述的非人动物，其中内源F12基因座从起始密码子到终止密码子的区域已被缺失并替换为所述对应的人F12序列。10.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中内源F12 3'非翻译区尚未被缺失并且尚未替换为所述对应的人F12序列。11.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中内源F12 5'非翻译区尚未被缺失并且尚未替换为所述对应的人F12序列。12.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中内源F12基因座从起始密码子到终止密码子的区域已被缺失并替换为所述对应的人F12序列，并且其中内源F12启动子尚未被缺失并且尚未替换为所述对应的人F12序列。13.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中：(i)所述人源化内源F12基因座处的所述人F12序列包括与SEQ ID NO:31或32中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；和/或(ii)所述人源化内源F12基因座对蛋白质进行编码，所述蛋白质包括与SEQ ID NO:5或46中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；和/或(iii)所述人源化内源F12基因座包括编码序列，所述编码序列包括与SEQ ID NO:13或48中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；和/或(iv)所述人源化内源F12基因座包括与SEQ ID NO:17或18中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。14.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述人源化内源F12基因座包括位于所述对应的人F12序列的内含子内的选择盒或报告基因，或者其中所述人源化内源F12基因座不包括选择盒或报告基因。15.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物对于所述人源化
内源F12基因座是纯合的。16.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物在其种系中包括所述人源化内源F12基因座。17.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物是哺乳动物。18.根据权利要求17所述的非人动物，其中所述非人动物是大鼠或小鼠。19.根据权利要求18所述的非人动物，其中所述非人动物是小鼠。20.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物在脑中表达短人凝血因子XII同种型。21.根据权利要求20所述的非人动物，其中：(i)所述短人凝血因子XII同种型由F12 mRNA进行编码，所述F12 mRNA由针对人F12的外显子11
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14的探针检测，但不由针对人F12的外显子1
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6的探针检测；和/或(ii)所述短人凝血因子XII同种型是FXII
297
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596
；和/或(iii)所述短人凝血因子XII同种型在脑的神经元中表达；和/或(iv)所述短人凝血因子XII同种型可由血浆激肽释放酶活化，并将pro
‑
HGF转化为活性HGF。22.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人动物具有与对应的野生型非人动物中的活化部分凝血活酶时间(aPTT)无显著差异的aPTT，和/或其中所述非人动物具有与对应的野生型非人动物中的前凝血酶时间(PT)无显著差异的PT。23.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物，其中所述非人的人凝血因子XII血浆水平为至少约5μg/mL。24.一种非人动物细胞，其基因组中包括人源化内源F12基因座，在所述基因座中，内源F12基因座的区段已被缺失并替换为对应的人F12序列。25.一种非人动物基因组，其包括人源化内源F12基因座，在所述基因座中，内源F12基因座的区段已被缺失并替换为对应的人F12序列。26.一种用于产生人源化内源F12基因座的靶向载体，在所述基因座中，内源F12基因座的区段已被缺失并替换为对应的人F12序列，其中所述靶向载体包括插入核酸，所述插入核酸包括侧接有靶向内源F12基因座处的5'靶序列的5'同源臂和靶向内源F12基因座处的3'靶序列的3'同源臂的对应的人F12序列。27.一种人源化非人动物F12基因，其中内源F12基因座的区段已被缺失并替换为对应的人F12序列。28.一种在体内评估靶向人凝血因子XII的试剂的活性的方法，所述方法包括：(a)向根据权利要求1到23中任一项所述的非人动物施用所述靶向人凝血因子XII的试剂；以及(b)评估所述靶向人凝血因子XII的试剂在所述非人动物中的活性。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述施用包括腺相关病毒(AAV)介导的递送、脂质纳米颗粒(LNP)介导的递送、流体动力学递送(HDD)或注射。30.根据权利要求28或29所述的方法，其中步骤(b)包括从所述非人动物中分离出血浆并评估所述靶向人凝血因子XII的试剂在所述血浆中的活性。31.根据权利要求28到30中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估所述靶向人凝血
因子XII的试剂在所述非人动物的肝脏或脑中的活性。32.根据权利要求28到31中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估凝血或凝血酶生成。33.根据权利要求28...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐亚俊，丹，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：