【技术实现步骤摘要】
一种新型病原体抗体检测方法及其检测新冠病毒抗体应用
[0001]本专利技术属生物医药领域,具体为一种新型病原体抗体检测方法及以其为基础发展的一种新型冠状病毒IgG/IgM抗体磁珠荧光检测试剂盒及其应用方法。
技术介绍
[0002]精准定量评价病原体特异性抗体对诊断病原体感染、评估病原体感染疾病进程及评价病原体疫苗免疫效果具有重要意义。如乙肝病毒核心抗原特异性抗体可作为发生乙肝病毒感染的诊断指标,而乙肝病毒表面抗体活性则可作为评价乙肝疫苗诱导保护性免疫反应的重要指标。新冠肺炎(COVID
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19)是由新型冠状病毒(SARS
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2)感染导致的一种严重威胁人类健康的重大传染性疾病。对新冠病毒特异性IgG和IgM抗体联合开展检测是一种有效的新冠病毒感染辅助诊断方法。国家卫生健康委员会在其发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中明确指出新冠病毒特异性IgM抗体、IgG抗体阳性可作为疑似病例确诊的证据之一。
[0003]目前,国内外市场检测病原体特异性抗体的主流检测方法为胶体金检测法和化学发光检测法。胶体金法优点在于检测快速、操作简便、无需仪器辅助,但只可定性测定,假阳性率较高。化学发光法是利用化学反应所产生的荧光进行测定的一种方法,由于荧光的强度高,使得这种检测方法具有很高的灵敏度,可进行高通量定量分析。但每次检测只能检测一个参数,因此无法同时对多个抗体类型进行检测。磁珠免疫荧光抗体检测技术是一种结合磁珠载体可高通量自动化操作优势和流式细胞仪高灵 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种新型病原体抗体检测方法,其特征在于:包括以下步骤:步骤1,目标病原体蛋白磁珠和内参磁珠的制备和保存:将目标病原体蛋白和内参蛋白通过化学共价交联或生物素/链霉亲和素系统饱和固相于微磁珠表面,制备出目标病原体蛋白磁珠和内参磁珠;将制备的目标病原体蛋白磁珠和内参磁珠保存于含有质量体积百分比为0.02%的叠氮化钠的抗体稀释液;步骤2,样品预处理:对待测血源样品以预先确定好的优选稀释度用样品稀释液进行稀释,以100μL/孔把稀释的样品加入到圆底96孔板的两个孔内,室温下孵育至少5分钟;步骤3,磁珠预处理:根据待测样品的数量,以至少5000个步骤1中制备的目标病原体蛋白磁珠或内参磁珠/反应吸取一定数量的目标病原体蛋白磁珠和内参磁珠至圆底96孔板两孔内,用抗体稀释液以200μL/孔清洗两次;以200μL抗体稀释液轻轻重悬磁珠2~3次,然后把圆底96孔板放在磁极上至少吸附3分钟,吸弃孔内上清液后完成一次清洗;在进行下一次磁珠清洗时,要把96孔板从磁极上取下后再重新加入200μL抗体稀释液对磁珠进行重悬;步骤4,抗原
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抗体反应:根据待测样品的数量,以5μL/样品对步骤3清洗后的目标病原体蛋白磁珠和内参磁珠用抗体稀释液进行重悬,后把5μL目标病原体蛋白磁珠和内参磁珠分别加入到步骤2中准备的两个含有100μL稀释后样品的两个孔内,轻轻吹匀后室温下孵育至少30分钟;步骤5,清洗磁珠:用磁极吸附孔板内磁珠,吸弃上清;从磁极上取下孔板,再向磁珠孔中加入200μL洗涤液重悬磁珠,把微孔板置于磁极上3分钟,吸弃上清,保留磁珠于板底;重复本步骤清洗磁珠共3次;步骤6,荧光标记二抗染色:抗体稀释液稀释荧光物质标记的动物抗待测血源样品所来源物种某型抗体的二抗至可饱和染色血源样品预孵育目标病原体蛋白磁珠的浓度;后以100μL稀释的二抗液/孔加入步骤5中准备的各孔,吹吸重悬磁珠,室温避光孵育30分钟;步骤7,清洗磁珠:用磁极吸附孔板内磁珠,吸弃上清;从磁极上取下孔板,再向磁珠孔中加入200μL洗涤液重悬磁珠,把微孔板置于磁极上3分钟,吸弃上清,保留磁珠于板底;重复本步骤清洗磁珠共2次;最后一次清洗后,用200μL洗涤液重悬磁珠;步骤8,样品的检测:根据步骤6中的荧光物质标记的动物抗某物种某型抗体所用荧光物质确定流式细胞仪检测激光管和检测光路;然后用流式细胞分析仪在该荧光物质对应的荧光光路对步骤7中清洗、重悬后的目标病原体蛋白磁珠和参考磁珠进行检测,并计算经同一样品所孵育的目标病原体蛋白磁珠和参考磁珠经相同荧光光路检测后前者相对后者的磁珠相对阳性百分率,该参数即代表所测样品中含有的目标病原体蛋白特异性某型抗体的活性。2.根据权利要求1所述的一种新型病原体抗体检测方法,其特征在于:所述目标病原体蛋白和内参蛋白通过化学共价交联固相于微磁珠表面,包括但不限于(1)目标病原体蛋白或内参蛋白中的伯氨基和巯基与表面甲苯磺酰基化的微磁珠通过共价键直接交联;(2)目标病原体蛋白或内参蛋白中的伯氨基与表面带有羧酸基团的微磁珠形成共价酰胺键进行交联;(3)目标病原体蛋白或内参蛋白中的羧酸基团与表面带有氨基基团的微磁珠通过醛的还原胺化进行共价结合。
3.根据权利要求2所述的一种新型病原体抗体检测方法,其特征在于:所述目标病原体蛋白和内参蛋白通过生物素/链霉亲和素系统固相于微磁珠表面,包括目标病原体蛋白和内参蛋白通过化学方法对目标病原体蛋白和内参蛋白进行生物素化后与表面固相有链霉亲和素磁珠共孵育进行蛋白固相;或是目标病原体蛋白和内参蛋白在其C端或N端与His标签及AVI标签进行融合表达的重组蛋白经生物素连接酶的作用下被生物素标记,然后通过AVI标签进行生物素化的蛋白与表面固相有链霉亲和素的微磁珠共孵育进行蛋白固相。4.根据权利要求3所述的一种新型病原体抗体检测方法,其特征在于:所述内参磁珠需要同时满足以下要求:(1)内参磁珠在分别经血清或血浆样品孵育、荧光标记二抗染色及流式细胞仪检测后,内参磁珠产生明显的假阳性染色可能性极低,概率<1%;(2)含目标病原体抗体的血清或血浆样品孵育及二抗染色的内参磁珠与不含目标病原体抗体的血清或血浆样品孵育及二抗染色的内参磁珠之间的平均荧光强度没有显著性差异;(3)内参磁珠与目标病原体蛋白磁珠分别经血清或血浆样品孵育、荧光标记二抗染色及流式细胞仪检测后,以含目标病原体抗体的血清或血浆所孵育的目标病原体蛋白磁珠与内参磁珠之间的磁珠相对阳性百分率显著高于以不含目标病原体抗体的血清或血浆所孵育的目标病原体蛋白磁珠与内参磁珠之间的磁珠相对阳性百分率,从而可以有效区分含目标病原体特异性抗体的血清或血浆样品和不含目标病原体抗体的血清或血浆样品。5.根据权利要求4所述的一种新型病原体抗体检测方法,其特征在于:所述抗体稀释液为含有0.1~0.5%不含IgG的牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液,pH值为7.2~7.4;所述微磁珠的磁珠直径为0.8~5μm。6.根据权利要求5所述的一种新型病原体抗体检测方法,其特征在于:所述洗涤液为含有体积百分比为0.025%吐温的0.01M磷酸盐缓冲液,pH值为7.4;所述荧光物质包括荧光染料、荧光蛋白、荧光染料/荧光蛋白合成物及量子点。7.根据权利要求6所述的一种新型病原体抗体检测方法,其特征在于:所述步骤2中优选稀释度通过下列方法进行确定:将待测血源样本用样本稀释液按1:10~1:80稀释;以无目标病原体感染经历的所测样品同种血源样品为阴性对照样品;以一组阴性对照样品在1:10~1:80范围稀释后与目标病原体蛋白磁珠孵育并经荧光物质标记二抗染色后,磁珠发生明显假阳性荧光染色频率低于10%的最小稀释度为待测样品的优选稀释度。8.根据权利要求7所述的一种新型病原体抗体检测方法,其特征在于:所述样品稀释液包含以体积百分数记的对待测物种血源样品与目标病原体蛋白磁珠及内参磁珠非特异结合有较好封闭作用的、且与待测物种不同种类的动物血清5~10%、甘油4~8%、0.1~1%吐温20、硼酸盐缓冲液30~50%、无菌去离子水30~50%,并用NaOH将pH调节至7.4。9.根据权利要求8所述的一种新型病原体抗体检测方法,其特征在于:所述步骤6中可饱和染色血源样品预孵育目标病原体蛋白磁珠的浓度通过以下方法进行确定:对用样品稀释液以优化稀释度稀释的含有目标病原体蛋白抗体的血源样品孵育的目标病原体蛋白磁珠,在清洗后与用抗体稀释液稀释的一系列不同浓度的荧光物质标记的抗所测血源样品中某类抗体的二抗染色后,目标病原体蛋白磁珠平均荧光强度达到高台水平所对应的二抗终浓度。10.根据权利要求9所述的一种新型病原体抗体检测方法,其特征在于:所述步骤8样品的检测中:在用流式细胞分析仪对磁珠进行检测时,首先通过调节电压在FSC和SSC门中找
到并圈定磁珠群,再从磁珠群收集2000个或以上磁珠,对所收集磁珠在荧光物质标记二抗对应的荧光通路对磁珠荧光染色情况进行分析;用流式分析软件对流式数据进行分析时,在荧光物质标记二抗相对应的荧光通道画组方图对内参磁珠和目标病原体蛋白磁珠的染色图进行分析;以内参磁珠染色图的右测边缘画门,分析目标病原体蛋白磁珠染色图在该门内的磁珠荧光染色百分率;该百分率数值就是目标病原体蛋白磁珠和内参磁珠经相同荧光光路检测后的磁珠相对阳性百分率;以该数值为依据既可对所测血源样品中目标病原体蛋白特异性抗体的活性进行定量分析也可对所测血源样品是否存在病原体蛋白特异性抗体进行定性判断。11.一种如权利要求1所述新型病原体抗体检测方法检测新冠病毒抗体应用,其特征在于:所述检测新冠病毒抗体应用包括一种新型冠状病毒IgG/IgM抗体磁珠荧光检测试剂盒。12.根据权利要求11所述的新型病原体抗体检测方法检测新冠病毒抗体应用,其特征在于:所述试剂盒包括S1蛋白磁珠、内参磁珠、荧光物质标记的动物抗人IgG抗体、荧光物质标记的动物抗人IgM抗体、SARS
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2IgG抗体阴性质控品、SARS
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2IgG抗体阳性质控品、SARS
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2IgM抗体阴性质控品、SARS
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2IgM抗体阳性质控品、样品稀释液、抗体稀释液和浓缩洗涤液。13.根据权利要求12所述的新型病原体抗体检测方法检测新冠病毒抗体应用,其特征在于:所述S1蛋白磁珠和内参磁珠通过以下方法制备得到:在每20μL 0.01MpH值为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中以每10μg固相有链霉亲和素的磁珠对200~800ng的预生物素化重组新型冠状病毒刺突蛋白S1亚基或预生物素化重组人血管紧张转化酶2蛋白为比例,其中预生物素化重组新型冠状病毒刺突蛋白S1亚基用S1蛋白表示,预生物素化重组人血管紧张转化酶2蛋白用ACE2蛋白表示;把S1蛋白或ACE2蛋白固相到磁珠上;室温下共孵育40min,在共孵育20min后吹吸重悬一次,共孵育后把固相有S1蛋白的链霉亲和素磁珠或固相有ACE2蛋白的链霉亲和素磁珠转入一个新的容器中,置于2℃~8℃,当磁珠完全沉降于底部后,吸弃上清;以含有质量体积百分比为0.02%叠氮化钠的抗体稀释液重悬磁珠沉淀,体积为固相时磷酸盐缓冲液体积的4倍,制备成S1蛋白磁珠和内参磁珠。14.根据权利要求13所述的新型病原体抗体检测方法检测新冠病毒抗体应用,其特征在于:所述荧光物质标记的动物抗人IgG抗体浓度为1~1000μg/mL;所述荧光物质标记的动物抗人IgG抗体中的荧光物质包括但不限于荧光染料、荧光蛋白、荧光染料/荧光蛋白合成物及量子点,要求该荧光物质与标记动物抗人IgM抗体中的荧光物质在流式细胞仪检测时所用光路不同;所述荧光物质标记动物抗人IgG抗体中的动物包括但不限于小鼠、山羊、绵羊、牛、驴、兔、大鼠及...
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