【技术实现步骤摘要】
一种携带HA标签的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的制备方法
[0001]本专利技术涉及一种携带HA标签的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的制备方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
[0002]乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是由黄病毒科的乙型脑炎病毒(JE virus,JEV)引起的人和动物共患的一种由蚊虫为媒介传播的病毒性疾病,对人类危害巨大,是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一,对猪可引起繁殖障碍,给养猪业造成巨大的经济损失；猪是JEV的扩增宿主,带毒猪是本病的主要传染源,因此,防制猪患乙脑不但可以减少养猪业的损失,而且也是防制乙脑的重要措施。
[0003]乙脑病毒基因为单股正链RNA,长约11kb,有单一开放的阅读框,能编码,翻释,加工成多种结构蛋白和非结构蛋白,其病毒的结构蛋白有3种:囊膜蛋白E,膜蛋白M(由膜前体蛋白PrM加工而来),以及衣壳蛋白C和7种非结构蛋白NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5；其中M蛋白参与病毒囊膜的构成,对维持E蛋白的结构是十分必要的,E...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种携带HA标签的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其制备方法具体包括下述步骤：1)pSH7
‑
2332
‑
4497
‑
HA/NS2A质粒的构建：设计两组含有HA标签的引物对并以pSH7
‑
2332
‑
4497为模板扩增出相互重叠度的两段位于2332
‑
4497bp的DNA片段，得到目的片段II
‑
1和目的片段II
‑
2，其中引物对1的上游引物如SEQ.No.1所示，引物对1的下游引物如SEQ.No.2所示，引物对2的上游引物如SEQ.No.3所示，引物对2的下游引物如SEQ.No.4所示；将目的片段II
‑
1和目的片段II
‑
2利用Fusion
‑
PCR的方法融合并与线性化的POK
‑
12质粒连接，命名为pSH7
‑
2332
‑
4497
‑
HA/NS2A；2)pSH7
‑
2332
‑
4497
‑
HA/NS2A/
‑
ΔNS1'质粒构建：利用定点突变引物对对pSH7
‑
2332
‑
4497
‑
HA/NS2A质粒上的NS2A蛋白的A30位点进行定点的突变，引物对的正向引物为SEQ.No.7所示，引物对的反向引物为SEQ.No.8所示。3)pSH7
‑
2332
‑
4497
‑
HA/NS2A/C221S/
‑
ΔNS1'质粒构建：以pSH7
‑
2332
‑
4497
‑
HA/NS2A/
‑
ΔNS1'为模板，利用定点突变引物对质粒上的NS2A蛋白的C221位点进行定点的突变，引物对的正向引物为SEQ.No.9所示，引物对的反向引物为SEQ.No.10所示；4)JEV全长cDNA的克隆：分别以pSH7T7
‑1‑
2361，pSH7
‑
2332
‑
4497
‑
HA/NS2A或pSH7
‑
2332
‑
4497
‑
HA/NS2A/
‑
ΔNS1'，pSH7
‑
2332
‑
4497
‑
HA/NS2A/C221S/
‑
ΔNS1'，pSH7
‑
4468
‑
7664，pSH7
‑
7636
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10965为模板，扩增出JEV相互重叠的四个片段，再利用Fusion
‑
PCR的方法获得病毒的基因组的全长cDNA序列；5)体外转录：将回收的JEV全长cDNA进行体外转录，获得7
‑
甲基鸟嘌呤加帽的病毒RNA；6)转染JEV RNA拯救病毒：使用DMRIE
‑
C试剂将病毒RNA转录本转染到BHK细胞中，收集转染细胞及上清，在发生乙脑病毒细胞病变效应后在BHK
‑
21细胞扩增病毒，拯救出来的重组病毒均经测序证实，丢弃含有任何不需要的突变的重组病毒的克隆体即可得到携带HA标签的乙型脑炎病毒全长感染性克隆。2.根据权利要求1所述的携带HA标签的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其特征在于，所述制备方法步骤1中具体包括如下步骤：(1)以pSH7
‑
2332
‑
4497为模板，扩增得到目的片段II
‑
1和目的片段II
‑
2，随后进行核酸电泳，胶回收，测定DNA片段浓度。其中扩增反应体...
【专利技术属性】
技术研发人员：马志永，马晓春，魏建超，张妍，邱亚峰，李蓓蓓，李宗杰，刘珂，邵东华，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：
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