血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除鼠构建实验方法技术

本发明专利技术涉及血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除鼠构建实验方法，具体包括以下步骤：1)繁育足够数量的PDHA1

【技术实现步骤摘要】
血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除鼠构建实验方法


[0001]本专利技术涉及一种血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除鼠构建实验方法。

技术介绍

[0002]血管内皮细胞(Endothelialcell，EC)的能量代谢方式与许多疾病有关，已有研究显示，在动脉粥样硬化的发生发展中，血管内皮细胞的氧化应激反应引起氧化代谢失衡，分泌高水平的ROS能够降低NO和硫化氢产生，引起EC炎症反应增强、白细胞黏附增加、血小板聚集，形成恶性循环，加剧动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的进程，CoQ10作为线粒体呼吸链的一个重要组成部分之一，能够促进代谢在AS的防治中发生作用。HE等发现通过基因敲除Sirt3基因后，EC的耗氧量增加，但血管新生能力降低，心肌细胞因缺氧功能丧失，因而EC功能的糖酵解途径与心肌功能息息相关。血管内皮细胞通过糖酵解途径促进巨噬细胞向M2型极化，提高肌肉再生能力。而在敲除PFKFB3后，巨噬细胞向M1型极化，肌肉再生降低。由此可见，血管内皮细胞的呼吸代谢方式与疾病的发生发展有密切关系。血管内皮细胞虽然是以糖酵解为主要的代谢方式，但是以线粒体呼吸为主的有氧磷酸化在内皮细胞并未消失。PDHA1基因是编码丙酮酸脱氢酶1(PDHE1)重要亚基的载体基因，是连接糖酵解与三羧酸循环的枢纽，是能量调控的关键基因。魏琼等的研究显示，PDHA1基因缺乏能够引起Leigh综合征，引起乳酸堆积在神经肌肉系统，发生相关疾病。PDHA1与多种疾病及肿瘤发生有关。Sirt3通过HIF1α/PDK1/PDHA1通路抑制胆管癌肿瘤的发生而发挥抗Warburg作用。目前，关于PDHA1基因与肿瘤的研究多限于细胞和分子层面，而血管内皮细胞特异性敲除小鼠的构建技术较为成熟，但PDHA1基因在血管内皮细胞的敲除首次构建，在动物整体水平分析PDHA1基因在血管内皮细胞相关疾病中的表达来映射能量代谢在不同疾病的作用。通过改变内皮细胞的能量代谢方式可能对疾病的发生发展产生影响Cre/LoxP重组酶是构建条件性基因敲除鼠常用的技术，其中Cre重组酶包括2种，一种是从妊娠期进行的条件性基因敲除，一般表示为Cre重组酶；另一种是可诱导重组酶，一般表示为CreERT2重组酶，CreERT2是Cre重组酶与雌激素受体组成的融合蛋白，其中ER配体能够与他莫昔芬结合，从而介导CreERT2重组酶从细胞质进入细胞核，切除2个同向的LoxP位点之间的DNA序列，使得在特定的时间和空间敲除或活化某特定靶向基因变得可控。为满足实验的可控性，采用了CreERT2重组酶系统用于内皮细胞PDHA1特异性敲除。我们通过同时通过Tamoxifen(他莫昔芬)诱导实现敲除同时期，造模干预同时期。建立PDHA1基因内皮细胞条件性敲除小鼠是研究内皮细胞呼吸代谢与疾病关系的重要途径。到目前为止，PDHA1基因研究多集中在肿瘤和PDHA1特异突变疾病，而在其他疾病中并未有报道。血管内皮细胞作为一种能够在各个脏器发挥作用的器官，血管内皮细胞的能量代谢可能与不同器官疾病有关。课题组前期发现灌胃能够缓解矽肺纤维化的发展，而血管内皮细胞的HGF基因敲除在纤维化的发展具有促进作用，本研究PDHA1基因血管内皮细胞特异性敲除鼠的繁育及鉴定为后续研究血管内皮细胞PDHA1基因与肺纤维化的相关机制提供实验基础，且为血管内皮细胞的能量代谢引起的其他疾病的研究提供了新思路。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除鼠构建实验方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除鼠构建实验方法，具体包括以下步骤：
[0005]1)繁育足够数量的PDHA1
‑
Tek
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creERT2
(f/f,+)
小鼠将上述2只雄鼠和4只雌鼠合笼，在雌鼠出现阴栓时确定雌鼠怀孕，在仔鼠出生后观察小鼠出生及其出生数量，待小鼠出生三四周后，小鼠以耳标作为标记，剪趾进行基因鉴定；仔鼠6周龄按75mg/kg体重剂量进行腹腔注射20mg/mL的他莫昔芬，每24h注射1次，连续注射5d，注射完毕后，8周龄取材；将肺组织右下叶进行肺叶灌注10％的OCT进行冰冻组织包埋，其余肺叶直接放入
‑
80℃；
[0006]2)小鼠基因鉴定：
[0007]2a)10
×
MGB溶液的配制：取1只50mL的干净离心管，向其中加入0.05mol的Tris晶体溶于50mL的去离子水，测其酸碱度并将其pH调至8.8；另取一只15mL的干净离心管，向其中加入0.02mL的(NH4)2SO4和10mL去离子水至完全溶解；另取一只15mL的干净离心管，向其中加入0.01mL的MgCl2和10mL去离子水；将上述溶液完全配好后，取6.7mL的Tris溶液置于干净的离心管里，加入830μL的(NH4)2SO4溶液，650μL的MgCl2溶液及1.82mL的ddH2O充分混匀；
[0008]2b)Lysismix的配制：取配制好的1mL10
×
MGB，50μL的100％TritonX，100μLβ
‑
巯基乙醇和8.4mL ddH2O混合均匀；
[0009]2c)小鼠脚趾消化提取DNA：取用已经配制计算好的Lysismix，向其中加入蛋白酶K，每200μLLysismix加入3μL蛋白酶K，现用现配，向盛有小鼠脚趾的EP管中加入120μL已配好的上述溶液，55℃水浴过夜裂解，95℃变性10min后11000r/min离心5min，取上清液；
[0010]2d)DNA复制及基因鉴定：向PCR的八联管中分别加入10μL诺维赞蓝酶，0.3μL上游引物及0.3μL下游引物，以及0.59μL提取好的DNA；在95℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃42s，40个循环，72℃5min，16℃保存，然后进行DNA扩增，将扩增的DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，曝光观察DNA条带；
[0011]3)Western blot检测小鼠肺组织中蛋白表达水平：无菌取小鼠的肺脏组织，用剪刀剪碎后，加入配比好的磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、PMSF和Lysis Buffer，高剪切分散乳化机充分破碎组织细胞，提取小鼠肺组织总蛋白；取部分总蛋白加入Loading buffer和超纯水将蛋白稀释为3μg/mL，95℃变性5min；取变性后蛋白样品10μL，10％SDS
‑
PAGE制胶电泳恒压80V后转120V；将凝胶的蛋白转移至PVDF膜上，恒压15V，75min，PBST缓冲液配制的5％脱脂奶粉封闭2h，加入1：1000稀释的PDHA1、1:1000稀释的HK2、1：500稀释的IDH及1∶5000稀释的GAPDH一抗稀释液4℃摇床孵育过夜，PBST缓冲液洗3次，每次10min；辣根过氧化物酶标二抗室温孵育2h，PBST缓冲液洗脱3次，每次10min；ECL化学发光法显像，曝光时间按本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除鼠构建实验方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)繁育足够数量的PDHA1
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Tek
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creERT2
(f/f,+)
小鼠将上述2只雄鼠和4只雌鼠合笼，在雌鼠出现阴栓时确定雌鼠怀孕，在仔鼠出生后观察小鼠出生及其出生数量，待小鼠出生三四周后，小鼠以耳标作为标记，剪趾进行基因鉴定；仔鼠6周龄按75mg/kg体重剂量进行腹腔注射20mg/mL的他莫昔芬，每24h注射1次，连续注射5d，注射完毕后，8周龄取材；将肺组织右下叶进行肺叶灌注10％的OCT进行冰冻组织包埋，其余肺叶直接放入
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80℃；2)小鼠基因鉴定：2a)10
×
MGB溶液的配制：取1只50mL的干净离心管，向其中加入0.05mol的Tris晶体溶于50mL的去离子水，测其酸碱度并将其pH调至8.8；另取一只15mL的干净离心管，向其中加入0.02mL的(NH4)2SO4和10mL去离子水至完全溶解；另取一只15mL的干净离心管，向其中加入0.01mL的MgCl2和10mL去离子水；将上述溶液完全配好后，取6.7mL的Tris溶液置于干净的离心管里，加入830μL的(NH4)2SO4溶液，650μL的MgCl2溶液及1.82mL的ddH2O充分混匀；2b)Lysismix的配制：取配制好的1mL10
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MGB，50μL的100％TritonX，100μLβ
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巯基乙醇和8.4mL ddH2O混合均匀；2c)小鼠脚趾消化提取DNA：取用已经配制计算好的Lysismix，向其中加入蛋白酶K，每200μLLysismix加入3μL蛋白酶K，现用现配，向盛有小鼠脚趾的EP管中加入120μL已配好的上述溶液，55℃水浴过夜裂解，95℃变性10min后11000r/min离心5min，取上清液；2d)DNA复制及基因鉴定：向PCR的八联管中分别加入10μL诺维赞蓝酶，0.3μL上游引物及0.3μL下游引物，以及0.59μL提取好的DNA；在95℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃42s，40个循环，72℃5min，16℃保存，然后进行DNA扩增，将扩增的DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，曝光观察DNA条带；3)Western blot检测小鼠肺组织中蛋白表达水平：无菌取小鼠的肺脏组织，用剪刀剪碎后，加入配比好的磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、PMSF和Lysis Buffer，高剪切分散乳化机充分破碎组织细胞，提取小鼠肺组织总蛋白；取部分总蛋白加入Loading buffer和超纯水将蛋白稀释为3μg/mL，95℃变性5min；取变性后蛋白样品10μL，10％SDS
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PAGE制胶电泳恒压80V后转120V；将凝胶的蛋白转移至PVDF膜上，恒压15V，75min，PBST缓冲液配制的5％脱脂奶粉封闭2h，加入1：1000稀释的PDHA1、1:1000稀释的HK2、1：500...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨安宁，孙岳，姜怡邓，刘志宏，郝玮，宝瑞，刘耀阳，王秋实，刘太阳，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：