一种体外微量促卵泡素生物学活性的快速检测和诊断方法技术

本发明专利技术提供一种体外微量促卵泡素生物学活性的快速检测和诊断方法，涉及生物医学技术领域，包含以下步骤：从少量尿液样品中浓缩FSH；进一步从浓缩的FSH样品中去掉LH，得到纯化的FSH；建立SNAP

【技术实现步骤摘要】
一种体外微量促卵泡素生物学活性的快速检测和诊断方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种体外微量促卵泡素生物学活性的快速检测和诊断方法。

技术介绍

[0002]促卵泡素(FSH)对于维持正常的生理和生殖功能有非常重要的作用，包括促进卵泡各种细胞生长、发育，以利卵母细胞的成熟。FSH由垂体前叶嗜碱性细胞合成、分泌的一类糖蛋白，由α、β两个亚基组成，α有85个氨基酸，β有115 个氨基酸，特异性由β亚基组成，分子量约30kD。
[0003]促卵泡素受体(FSHR)是一种G蛋白偶联受体。FSH通过激活FSHR，通过下游信号通路促进卵泡周围间质细胞分化为内、外两层泡膜细胞并合成促黄体生成素受体；促进卵泡颗粒细胞增生和颗粒细胞内的芳香化酶系统活化，使雄激素转化为雌激，同时促进卵泡液分泌，使卵泡细胞逐渐增大，增加重量。关于人类FSH激素异常的情况，主要包括FSH分泌量的不足以及分泌的FSH生物活性的缺失，这些情况都会引起排卵障碍和不孕。体外检测FSH浓度的方法主要包括放射免疫，酶联免疫和侧向流试纸条等，但是这些方法只适用于检测 FSH的浓度，而不能够检测其生物学活性。
[0004]目前体外商业化的FSH的活性测定可以通过1)小鼠或者其它小动物进行注射FSH，进而测量孕酮含量，卵巢增重或者计数排卵量；2)人促卵泡激素刺激人卵巢颗粒细胞肿瘤细胞(KGN)产生孕酮的含量来反映；3)利用转入促卵泡激素(FSH)受体及荧光素酶报告基因的转基因细胞进行FSH体外活性的检测方法。这三种方法都需要较大量的FSH和较长的时间，因此这些检测FSH生物活性的方法效率相对较低、成本高且不直观。对于体外诊断，尤其当从患者获取的FSH的量是非常有限的情况下，对于其生物活性的检测诊断，目前尚没有很好的可行性办法。本专利技术以标记在生物工程细胞膜上表达的重组人促卵泡激素受体蛋白为基础，以受体对FSH诱导引起的受体内在化为原理，为体外FSH 生物活性检测与诊断应用打下了基础,同时为其他激素类药物活性测定提供了相关的替代方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决现有技术中对于体外诊断，尤其当从患者获取的 FSH的量是非常有限的情况下，对于其生物活性的检测诊断，目前尚没有很好的可行性办法的技术问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0007]一种体外微量促卵泡素生物学活性的快速检测和诊断方法，包含以下步骤：
[0008]S1：取样：从少量尿液样品中浓缩纯化FSH；
[0009]S2：纯化FSH：从浓缩的样品中去掉LH，得到纯化FSH；
[0010]S3：建立SNAP
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FSHR HEK 293稳定表达细胞株；
[0011]S4：利用样品FSH刺激FSHR内在化；
[0012]S5：利用标准化的FSH刺激FSHR的内在化；
[0013]S6：获取FSHR内在化图像；
[0014]S7：利用Image J高内涵图像分析软件，比对待测样品和标准品的生物学活性。
[0015]优选的，所述S1的具体步骤：从待检对象采集尿液30ml，滤纸简单过滤去掉细胞组织碎片；
[0016]然后将尿液转到两个15ml的超滤管中，离心超滤。
[0017]超滤完成后，加入10ml的DMEM洗涤浓缩尿液蛋白，再次浓缩。
[0018]优选的，所述超滤管为amicon
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15，cutoff 10kD的超滤管。
[0019]优选的，所述S2的具体步骤为：将S1中得到的微量样品转入微量离心管，加入适量的LH抗体和Protein A适量珠子，离心去除尿液样品中的LH，得到 FSH样品供ELISA测定浓度和用于刺激FSHR内在化。
[0020]优选的，所述S2中LH抗体的加入量为400ng，Protein A适量珠子的加入量为20μL。
[0021]优选的，所述S3的具体方法为：将SNAP标签接入FSHR的ORF的5
’
端，再将表达质粒利用脂质体转染到HEK 293细胞，经过G418抗生素筛选得到稳定表达株。
[0022]优选的，所述S4的具体步骤为：利用SNAP染料标记FSHR和利用FSH诱导标记的FSHR内在化，稳定表达在HEK细胞膜上的SNAP
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FSHR使用snap特异染料共价标记。
[0023]优选的，所述S7的具体步骤为：将细胞接种到96孔板过夜，再用SNAP染料将受体标记；受体标记好了以后，分别用标准品和待测样品诱导FSHR内在化，再将细胞固定照相；用ImageJ软件计算单位面积里的细胞荧光内在化相对细胞数目；比对待测样品与国际标准品的结果，确定待测品的生物学活性。
[0024]优选的，标记受体需要30min。
[0025]本专利技术建立并验证了一种利用生物工程细胞株稳定表达的FSHR对FSH的反应，进一步用高内涵图像分析，在体外快速测定微量FSH生物学活性的方法。其中，利用我们的技术路线，可从尿中快速回收的去除了LH的FSH，回收率约为90％。在HEK293细胞中表达的FSHR，其内在化对微量FSH有很好的剂量反应关系。方法专属性符合要求；线围为0.01～50ng/mL，相关系数R2≥0.99。经3次重复测定标准品，结果显示该方法有很好的耐用性。测定市售重组人FSH 产品，其体外活性测定结果与传统动物体内活性测定结果高度一致。
[0026]我们的专利技术可以代替传统的动物体内FSH活性检测方法，可用于微量FSH 的生物学活性评价和快速医学诊断。
附图说明
[0027]图1为本专利技术提出一种体外微量促卵泡素生物学活性的快速检测和诊断方法的流程图；
[0028]图2为本申请中浓缩后FSH及LH的浓度及浓缩去LH后FSH与LH的浓度对比图；
[0029]图3为本申请SNAP染料标记在HEK细胞膜上表达的FSHR(左)及尿源FSH诱导FSHR内在化(右)的对比图。
[0030]图4为本申请高内涵图像分析和确定待检FSH的生物学活性单位对比图。
具体实施方式
[0031]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步地详细说明。
[0032]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是，本专利技术还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本专利技术并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
[0033]请参阅图1，一种体外微量促卵泡素生物学活性的快速检测和诊断方法，包含以下步骤：
[0034]S1：取样：从少量尿液样品中浓缩纯化FSH；
[0035]具体的，在一实施方式中，从待检对象采集尿液30ml，滤纸简单过滤去掉细胞组织碎片；
[0036]然后将尿液转到两个15ml的超滤管中，根据超滤管的使用说明，离心超滤，在一实施方式中，所述超滤管为amicon
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15，cuto本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外微量促卵泡素生物学活性的快速检测和诊断方法，其特征在于：包含以下步骤：S1：取样：从少量尿液样品中浓缩纯化FSH；S2：纯化FSH：从浓缩的样品中去掉LH，得到纯化FSH；S3：建立SNAP
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FSHR HEK 293稳定表达细胞株；S4：利用样品FSH刺激FSHR内在化；S5：利用标准化的FSH刺激FSHR的内在化；S6：获取FSHR内在化图像；S7：利用Image J高内涵图像分析软件，比对待测样品和标准品的生物学活性。2.根据权利要求1所述的体外微量促卵泡素生物学活性的快速检测和诊断方法，其特征在于：所述S1的具体步骤：从待检对象采集尿液30ml，滤纸简单过滤去掉细胞组织碎片；然后将尿液转到两个15ml的超滤管中，离心超滤；超滤完成后，加入10ml的DMEM洗涤浓缩尿液蛋白，再次浓缩。3.根据权利要求2所述的体外微量促卵泡素生物学活性的快速检测和诊断方法，其特征在于：所述超滤管为amicon
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15， cutoff 10kD的超滤管。4.根据权利要求1所述的体外微量促卵泡素生物学活性的快速检测和诊断方法，其特征在于：所述S2的具体步骤为：将S1中得到的微量样品转入微量离心管，加入适量的LH抗体和Protein A适量珠子，离心去除尿液样品中的LH，得到FSH样品供ELISA测定浓度和用于刺激FSHR内在化。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建喜，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：