工程改造铰链区以驱动抗体二聚化制造技术

多特异性抗体，例如双特异性和三特异性抗体的临床潜力显示出用于靶向复杂疾病的巨大希望。然而，这些分子的产生提出了巨大的挑战，因为在许多情况下，希望特异性地驱动存在于溶液中的多个多肽链的特异性配对。在重链的情况下，有两个形成二聚体界面的主要区。其中一个是CH3区，其通过以下已经被广泛利用：插入电荷对突变(CPM)来操控二聚体界面，或者将大体积残基插入空穴(杵

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程改造铰链区以驱动抗体二聚化


[0001]本专利技术涉及生物制药领域。特别地，本专利技术涉及能够特异性结合至少两种靶抗原的多特异性抗原结合蛋白。所述多特异性抗原结合蛋白在铰链区包含两个不同的重链，所述两个不同的重链利用电荷对突变来促进异二聚体形成，同时抑制同二聚体形成。

技术介绍

[0002]抗体已经成为生物制药工业中的选择形式，因为抗体具有一些吸引那些开发治疗性分子的特性。除了能够靶向特定结构或细胞外，抗体还能使其靶标易受Fc受体细胞介导的吞噬和杀伤作用的影响(Raghavan和Bjorkman 1996)。此外，抗体以pH依赖方式与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用的能力使其具有延长的血清半衰期(Ghetie和Ward 2000)。抗体的这种独特特性允许通过工程改造Fc融合分子来延长血清中治疗性蛋白或肽的半衰期。
[0003]在某些情况下，希望产生包含抗体的Fc部分但包含异二聚体的分子。Fc异二聚体分子的一个重要应用是产生多特异性抗体，例如，双特异性抗体。双特异性抗体是指对至少两种不同抗原具有特异性的抗体(Nolan和O'Kennedy 1990；de Leij,Molema等人1998；Carter2001)。双特异性抗体不是在两个Fab中具有相同的序列，而是在两个Fab中具有不同的序列，以便Y型分子的每个臂都能与不同的抗原结合。Fc异二聚体的另一个应用是将半衰期延长部分添加到治疗性分子中。在这种情况下，两个不同的Fc部分中的一个或两个可以融合到需要延长半衰期的一个或多个治疗性分子上。
[0004]产生Fc异二聚体的经典方法是由Carter及其合作者开发的，当时他们使用“杵
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臼(knobs
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into
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holes)”策略对重链工程改造用于异二聚化(Ridgway,Presta等人1996；Atwell,Ridgway等人1997；Merchant,Zhu等人1998；Carter 2001)。杵
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臼概念最初由Crick提出，作为相邻α
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螺旋间氨基酸侧链堆积的模型(Crick 1952)。Carter及其合作者通过用较大的氨基酸侧链替换较小的氨基酸侧链(例如，T366Y)，在第一链的CH3结构域界面处产生了杵；并且通过用较小的氨基酸侧链替换较大的氨基酸侧链(例如Y407T)，在第二链的CH3界面处的并置位置上产生了臼。在并置位置产生杵和臼的基础是杵和臼的相互作用有利于异二聚体的形成，而杵
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杵和臼
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臼的相互作用分别由于有利相互作用的空间冲突和缺失而阻碍同二聚体形成。杵
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臼突变还与被工程改造以增强异二聚体形成的CH3结构域间二硫键相组合(Sowdhamini,Srinivasan等人1989；Atwell,Ridgway等人1997)。除了这些突变外，还改变了输入DNA比率以使产量最大化(Merchant,Zhu等人1998)。“杵
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臼”技术在美国专利号5,731,168和7,183,076中公开。
[0005]多特异性抗体(同时靶向多个靶标的分子，例如双特异性和三特异性抗体)以及半衰期延长的治疗性蛋白的临床潜力显示出用于靶向复杂疾病的巨大希望。然而，这些分子的产生提出了巨大的挑战，因为在许多情况下，我们希望特异性地驱动存在于溶液中的多个多肽链的配对。在这里，我们描述了用少量突变对铰链区进行工程改造，这些突变能够单独成功地驱动Fc二聚化。

技术实现思路

[0006]在一个方面，本专利技术涉及一种分离的异多聚体，所述异多聚体包含异二聚免疫球蛋白铰链结构域，所述异二聚免疫球蛋白铰链结构域包含第一免疫球蛋白铰链结构域多肽和第二免疫球蛋白铰链结构域多肽，其中：
[0007](i)所述第一免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：P243K、A244K、P245K、N/E246K和L247K；并且
[0008](ii)所述第二免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：P243D、A244D、P245D、N/E246D和L247D；
[0009]其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
[0010]在另一方面，本专利技术涉及一种分离的异多聚体，所述异多聚体包含异二聚免疫球蛋白铰链结构域，所述异二聚免疫球蛋白铰链结构域包含第一免疫球蛋白铰链结构域多肽和第二免疫球蛋白铰链结构域多肽，其中：
[0011](i)所述第一免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：A244H；并且
[0012](ii)所述第二免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：N/E246D和L247D；
[0013]其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
[0014]在另一方面，本专利技术涉及一种分离的异多聚体，所述异多聚体包含异二聚免疫球蛋白铰链结构域，所述异二聚免疫球蛋白铰链结构域包含第一免疫球蛋白铰链结构域多肽和第二免疫球蛋白铰链结构域多肽，其中：
[0015](i)所述第一免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：H237K、T238K、A244K和N/E246K；并且
[0016](ii)所述第二免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：H237D、T238D、A244D和N/E246D；
[0017]其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
[0018]在某些实施例中，异多聚体的每个铰链结构域多肽还包含L248C取代。
[0019]在某些实施例中，每个免疫球蛋白铰链结构域多肽还包含CH3结构域。在一个实施例中，一个CH3结构域包含F405L、F405A、F405D、F405E、F405H、F405I、F405K、F405M、F405N、F405Q、F405S、F405T、F405V、F405W、或F405Y突变；并且另一个CH3结构域包含K409R突变；其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。在一个实施例中，一个CH3结构域包含T366W突变；并且另一个CH3结构域包含T366S、L368A、Y407V突变；其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。在一个实施例中，一个CH3结构域包含K/R409D和K392D突变；并且另一个CH3结构域包含D399K和E356K突变；其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。在一个实施例中，一个CH3结构域包含Y349C突变；并且另一个CH3结构域包含E356C或S354C突变；其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。在一实施例中，一个CH3结构域包含Y349C和T366W突变；并且另一个CH3结构域包含E356C、T366S、L368A和Y407V突变；其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。在一实施例中，一个CH3结构域包含Y349C和T366W突变；并且另一个CH3结构域包含S354C、T366S、L368A、Y407V突变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的异多聚体，所述异多聚体包含异二聚免疫球蛋白铰链结构域，所述异二聚免疫球蛋白铰链结构域包含第一免疫球蛋白铰链结构域多肽和第二免疫球蛋白铰链结构域多肽，其中：(i)所述第一免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：P243K、A244K、P245K、N/E246K和L247K；并且(ii)所述第二免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：P243D、A244D、P245D、N/E246D和L247D；其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。2.根据权利要求1所述的分离的异多聚体，其中每个铰链结构域多肽还包含L248C取代。3.一种分离的异多聚体，所述异多聚体包含异二聚免疫球蛋白铰链结构域，所述异二聚免疫球蛋白铰链结构域包含第一免疫球蛋白铰链结构域多肽和第二免疫球蛋白铰链结构域多肽，其中：(i)所述第一免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：A244H；并且(ii)所述第二免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：N/E246D和L247D；其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。4.根据权利要求3所述的分离的异多聚体，其中每个铰链结构域多肽还包含L248C取代。5.一种分离的异多聚体，所述异多聚体包含异二聚免疫球蛋白铰链结构域，所述异二聚免疫球蛋白铰链结构域包含第一免疫球蛋白铰链结构域多肽和第二免疫球蛋白铰链结构域多肽，其中：(i)所述第一免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：H237K、T238K、A244K和N/E246K；并且(ii)所述第二免疫球蛋白铰链结构域多肽包含下列氨基酸取代：H237D、T238D、A244D和N/E246D；其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。6.根据权利要求5所述的分离的异多聚体，其中每个铰链结构域多肽还包含L248C取代。7.根据任一前述权利要求所述的分离的异多聚体，其中每个免疫球蛋白铰链结构域多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：F，
申请(专利权)人：美国安进公司，
类型：发明
国别省市：