椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜制造技术

本实用新型专利技术公开了一种椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，包括：近红外飞秒脉冲激光器联组、分束延时模块联组、扫描单元联组、合束拼接模块、椭球曲面大视野反射式物镜、二向色片和光电倍增管探测阵列。本实用新型专利技术通过反射式物镜的设计来实现椭圆曲面大视野，能将平面矩形的激光扫描场转换成椭圆半球面的激光扫描场；通过多路激光并行扫描和多路荧光并行的探测方式能实现高通量扫描，利用四色原理，将不相邻区域划分为一组，利用区域间隙和合并式半波片最大化多次偏振合束的能量效率；不组激光之间引入延时，通过同时点的区域不相邻、相邻的区域不同时的方案，能有效区分荧光信号的来源区域，极大程度地避免荧光散射带来的信号串扰。号串扰。号串扰。

【技术实现步骤摘要】
椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜


[0001]本技术涉及显微成像仪器领域，特别涉及一种椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜。

技术介绍

[0002]双光子显微镜因为其深的生物组织成像深度和高的空间分辨力，目前在动物脑皮层的神经组织功能结构成像中得到了很好的应用，推动了神经科学(脑科学)的发展。
[0003]科学家希望能同时观察记录更大范围内更多的神经元的功能信号，对双光子成像技术提出了新的需求。首先需要达到神经元的分辨率，要求光学分辨率在1～2微米，对应到数值孔径为0.3～0.5；其次图像刷新速度需要至少5帧每秒，才能有效捕捉神经元的钙功能信号；在满足空间和时间分辨率的前提下，成像更大的视野范围，从而单次记录到的神经元数目更多。
[0004]目前国际上双光子成像的最大视野直径约为5mm，但全视野的成像速度小于1帧每秒，达不到功能信号探测的要求。在实时成像和单细胞分辨率条件下，双光子成像的视野面积仅为1mm
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1mm，对于小鼠来说也仅仅覆盖单个脑功能区。而小鼠全脑皮层面积约200mm2，而且脑表面是不平的，接近于一个椭圆半球，这对光学显微成像来说是一个极大的挑战。
[0005]动物在体脑皮层单神经元分辨动态大视野成像，需要解决两方面问题，一是在实现大成像视野面积的同时，令视野弯曲，与脑皮层曲率匹配，这与常规的平场物镜视野设计理念差异巨大；二是大视野高分辨图像要求像素数极多，同时保证时间分辨率，因此需要的成像数据通量是巨大的，因此需要让激光扫描和荧光探测通量呈数量级的提升。/>[0006]并行扫描和探测是提高激光扫描和荧光探测通量常用手段，将大面积视野划分为若干块区域，多个激光焦点分别进行独立扫描，以及结合多通道探测器或面阵探测器探测各个区域的荧光信号，可以显著提升成像通量。但是目前的并行扫描方案在多次合束拼接视野时激光能量损耗大，每经过一次消偏振合束棱镜，激光能量就减少一半；多通道并行探测存在由荧光散射带来的信号串扰，具体为荧光散射面积较大，荧光同时落在相邻的几个区域，造成通道间的信号串扰。
[0007]所以，现在需要一种更可靠的方案。

技术实现思路

[0008]本技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜。
[0009]为解决上述技术问题，本技术采用的技术方案是：一种椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，包括：近红外飞秒脉冲激光器联组、分束延时模块联组、扫描单元联组、合束拼接模块、椭球曲面大视野反射式物镜、二向色片和光电倍增管探测阵列；
[0010]所述近红外飞秒脉冲激光器联组发出的激光依次经过所述分束延时模块联组、扫描单元联组、合束拼接模块后透射所述二向色片，然后经过所述椭球曲面大视野反射式物
镜照射到样品上，样品被激发产生的荧光经过所述椭球曲面大视野反射式物镜收集后，被所述二向色片反射至所述光电倍增管探测阵列；
[0011]所述椭球曲面大视野反射式物镜包括沿光路依次设置的主镜、次镜和三镜，所述主镜的光学面为双曲面，所述次镜的光学面为扁椭圆面，所述三镜的光学面为扁椭圆面，进入所述椭球曲面大视野反射式物镜的激光经过所述主镜、次镜、三镜依次反射后照射到样品上；
[0012]所述近红外飞秒脉冲激光器联组包括4个近红外飞秒脉冲激光器；
[0013]所述分束延时模块联组包括4个分束延时模块，所述分束延时模块包括延时光路和分束光路；
[0014]所述扫描单元联组包括4个扫描单元，每个扫描单元包括4个独立的扫描模块，每个扫描模块独立实现1个矩形的子扫描区域的二维扫描；
[0015]每个所述近红外飞秒脉冲激光器对应1个所述分束延时模块，每个所述分束延时模块对应1个所述扫描单元；
[0016]4个所述近红外飞秒脉冲激光器发出的激光经过所述延时光路后形成依次具有T/4的时间间隔的4路延时激光，每路延时激光再经过所述分束光路后等分为4路子激光，来源于同一路延时激光的4路子激光进入同一个扫描单元，且每路子激光对应1个扫描模块用于实现1个子扫描区域的扫描，从而通过16路子激光与16个扫描模块一一对应，实现16个子扫描区域的扫描；其中，T为近红外飞秒脉冲激光器发出的激光的脉冲周期，进一步优选的实施例中，T＝12.5ns，则时间相邻的两组之间的延时相隔3.125ns；同一个扫描单元中的每个扫描模块扫描得到的子扫描区域处于同一时间位点，不同的扫描单元中的扫描模块扫描得到的子扫描区域位于不同的时间位点；
[0017]所述合束拼接模块用于实现16个扫描模块出射的16路子激光的合束拼接，通过将16个子扫描区域合束拼接，形成4
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4阵列分布的矩形扫描场，而且使得位于同一时间位点的4个子扫描区域边界不相邻，而边界相邻的任意4个区域在时间上位于不同的时间位点。
[0018]优选的是，所述主镜的光学面为八阶双曲面，所述次镜的光学面为二次扁椭圆面，所述三镜的光学面为六阶扁椭圆面。
[0019]进一步优选的，所述椭球曲面大视野反射式物镜的数值孔径范围为0.3～0.5。该反射式物镜的成像视野为椭球曲面，长轴曲率半径9～12mm，短轴曲率半径6～9mm，视野的平面投影尺寸为6mm
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6mm。
[0020]优选的是，所述延时光路包括第一反射镜和第二反射镜，所述近红外飞秒脉冲激光器发出的激光依次经过所述第一反射镜和第二反射镜反射后形成延时激光输出，通过调整所述第一反射镜和第二反射镜之间的距离使得输出的延时激光产生不同的延时量；
[0021]所述分束光路包括第一分光元件、第二分光元件和第三分光元件，所述第二反射镜输出的延时激光进所述第一分光元件后均分为两路，一路透射所述第一分光元件后到达所述第二分光元件，并被所述第二分光元件均分为两路，另一路被所述第一分光元件反射后到达所述第三分光元件，并被所述第三分光元件均分为两路，从而将延时激光均分为4路。
[0022]优选的是，所述第一分光元件、第二分光元件和第三分光元件均为消偏振分光棱镜或者为50/50分光片。
[0023]优选的是，所述扫描模块包括快轴共振扫描镜和慢轴检流计振镜。
[0024]优选的是，所述合束拼接模块包括4个一级合束拼接模块和1个二级合束拼接模块，每个一级合束拼接模块分别对应1个所述扫描单元，以将1个所述扫描单元中的4个扫描模块出射的4路子激光进行合束拼接；
[0025]所述二级合束拼接模块用于将4个所述一级合束拼接模块出射的4组激光再次进行合束拼接，然后输入到所述二向色片。
[0026]优选的是，所述一级合束拼接模块包括2个一级合束拼接子光路、一级偏振合束棱镜、第一一级透镜、一级合并式半波片和第二一级透镜，2个一级合束拼接子光路出射的激光经过所述一级偏振合束棱镜合束后再依次经过所述第一一级透镜、一级合并式半波片和第二一级透镜后输出，所述一级合并式半波片包括4个不同的半波片；
[0027]2个所述一级合束拼接子光路结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，包括：近红外飞秒脉冲激光器联组、分束延时模块联组、扫描单元联组、合束拼接模块、椭球曲面大视野反射式物镜、二向色片和光电倍增管探测阵列；所述近红外飞秒脉冲激光器联组发出的激光依次经过所述分束延时模块联组、扫描单元联组、合束拼接模块后透射所述二向色片，然后经过所述椭球曲面大视野反射式物镜照射到样品上，样品被激发产生的荧光经过所述椭球曲面大视野反射式物镜收集后，被所述二向色片反射至所述光电倍增管探测阵列；所述椭球曲面大视野反射式物镜包括沿光路依次设置的主镜、次镜和三镜，所述主镜的光学面为双曲面，所述次镜的光学面为扁椭圆面，所述三镜的光学面为扁椭圆面，进入所述椭球曲面大视野反射式物镜的激光经过所述主镜、次镜、三镜依次反射后照射到样品上；所述近红外飞秒脉冲激光器联组包括4个近红外飞秒脉冲激光器；所述分束延时模块联组包括4个分束延时模块，所述分束延时模块包括延时光路和分束光路；所述扫描单元联组包括4个扫描单元，每个扫描单元包括4个独立的扫描模块，每个扫描模块独立实现1个矩形的子扫描区域的二维扫描；每个所述近红外飞秒脉冲激光器对应1个所述分束延时模块，每个所述分束延时模块对应1个所述扫描单元；4个所述近红外飞秒脉冲激光器发出的激光经过所述延时光路后形成依次具有T/4的时间间隔的4路延时激光，每路延时激光再经过所述分束光路后等分为4路子激光，来源于同一路延时激光的4路子激光进入同一个扫描单元，且每路子激光对应1个扫描模块用于实现1个子扫描区域的扫描，从而通过16路子激光与16个扫描模块一一对应，实现16个子扫描区域的扫描；其中，T为近红外飞秒脉冲激光器发出的激光的脉冲周期；同一个扫描单元中的每个扫描模块扫描得到的子扫描区域处于同一时间位点，不同的扫描单元中的扫描模块扫描得到的子扫描区域位于不同的时间位点；所述合束拼接模块用于实现16个扫描模块出射的16路子激光的合束拼接，通过将16个子扫描区域合束拼接，形成4
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4阵列分布的矩形扫描场，而且使得位于同一时间位点的4个子扫描区域边界不相邻，而边界相邻的任意4个区域在时间上位于不同的时间位点。2.根据权利要求1所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述主镜的光学面为八阶双曲面，所述次镜的光学面为二次扁椭圆面，所述三镜的光学面为六阶扁椭圆面。3.根据权利要求1所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述延时光路包括第一反射镜和第二反射镜，所述近红外飞秒脉冲激光器发出的激光依次经过所述第一反射镜和第二反射镜反射后形成延时激光输出，通过调整所述第一反射镜和第二反射镜之间的距离使得输出的延时激光产生不同的延时量；所述分束光路包括第一分光元件、第二分光元件和第三分光元件，所述第二反射镜输出的延时激光进所述第一分光元件后均分为两路，一路透射所述第一分光元件后到达所述第二分光元件，并被所述第二分光元件均分为两路，另一路被所述第一分光元件反射后到达所述第三分光元件，并被所述第三分光元件均分为两路，从而将延时激光均分为4路。4.根据权利要求3所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述第
一分光元件、第二分光元件和第三分光元件均为消偏振分光棱镜或者为50/50分光片。5.根据权利要求1所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述扫描模块包括快轴共振扫描镜和慢轴检流计振镜。6.根据权利要求3所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述合束拼接模块包括4个一级合束拼接模块和1个二级合束拼接模块，每个一级合束拼接模块分别对应1个所述扫描单元，以将1个所述扫描单元中的4个扫描模块出射的4路子激光进行合束拼接；所述二级合束拼接模块用于将4个所述一级合束拼接模块出射的4组激光再次进行合束拼接，然后输入到所述二向色片。7.根据权利要求6所述的椭半球...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐玉国，周镇乔，李敏，吕晶，王艳，刘勤颖，陈月岩，贾宏博，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：新型
国别省市：