一种3制造技术

本发明专利技术提供了一种3

【技术实现步骤摘要】
一种3
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FLAG标签融合表达载体的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种3
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FLAG标签融合表达载体的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]FLAG是一段由8个氨基酸残基(N
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DYKDDDDK
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C)组成的多肽,大约1012Da。在蛋白质表达、蛋白质互作等研究中,可以通过基因工程技术手段将所要研究的目的基因和FLAG多肽序列连接起来,FLAG多肽可以连接在目的蛋白的C端或N端,然后将“目的基因
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FLAG”融合后的表达载体转入细菌、酵母、动物或者植物细胞中。一方面，因为FLAG标签的分子量很小，所以不会遮盖住融合蛋白中的蛋白表位和结构域，也不容易改变融合蛋白的功能、定位、分泌和运输等。FLAG标签中的四个连续的天冬氨酸(DDDD)带负电荷，可以让整个标签具有天然的亲水特性，使得FLAG标签很容易定位在融合蛋白的表面，便于利用抗体来检测。另一方面，目前FLAG标签蛋白的抗体已经商业化大规模生产，很多品牌如国外品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种3
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FLAG标签融合表达载体的制备方法，其特征在于，该方法为：S1、用KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体，在温度为37℃的条件下反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下4.8Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物；S2、以pRGEB32Bar
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Cas9质粒为模板，以特异性引物F1和特异性引物R1为引物进行PCR反应克隆2
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35S启动子，PCR扩增后，将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，切下677bp大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，得到2
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35S启动子PCR回收产物；PCR反应体系为：2
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Pfu Master Mix 10μL，特异性引物F11μL、特异性引物R11μL、pRGEB32Bar
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Cas9质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；PCR扩增的反应条件为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸40s，扩增40个循环；68℃延伸10min；所述特异性引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述特异性引物R1核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；S3、利用同源重组方法将S2中得到的2
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35S启动子PCR回收产物中的2
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35S启动子连接至S1中得到的KpnI/XhoI双酶切pGL3 Basic载体的回收产物中pGL3 Basic载体的KpnI/XhoI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL
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35S连接产物，将所述pGL
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35S连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL
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35S；S4、将S3中得到的中间载体pGL
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35S用XhoI/SalI双酶切，在温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下3.67Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到XhoI/SalI双酶切中间载体pGL
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35S的回收产物；S5、人工合成多克隆位点MCS正向引物和多克隆位点MCS反向引物，将所述多克隆位点MCS正向引物和所述多克隆位点MCS反向引物在95℃的条件下退火5min，得到MCS退火引物；所述多克隆位点MCS正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述多克隆位点MCS反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；S6、将S5中得到的MCS退火引物T4连接至S4中得到的XhoI/SalI双酶切中间载体pGL
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35S的回收产物中pGL
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35S的XhoI/SalI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL
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35S
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MCS连接产物；将所述pGL
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35S
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MCS连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL
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35S
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MCS；S7、克隆Nos Ter序列：以pCambia1302质粒为模板，以特异性引物F2和特异性引物R2为引物进行PCR反应克隆Nos Ter序列，PCR扩增后，将PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，切下251bp大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，得到Nos Ter序列PCR回收产物；PCR反应体系为：2
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Pfu Master Mix 10μL，特异性引物F21μL、特异性引物R21μL、pCambia1302质粒1μL、灭菌超纯水补至20μL；PCR扩增的反应条件为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；所述特异性引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述特异性引物R2核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；S8、将S6中得到的中间载体pGL
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35S
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MCS用EcoRI/SalI双酶切，在温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下3.72Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL
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35S
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MCS的回收产物；S9、利用同源重组方法将S7中得到的Nos Ter序列PCR回收产物中的Nos Ter序列连接至S8中得到EcoRI/SalI双酶切中间载体pGL
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35S
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MCS的回收产物中的pGL
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35S
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MCS的
EcoRI/SalI位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pGL
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35S
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MCS
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Nos连接产物，将所述pGL
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35S
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MCS
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Nos连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pGL
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MCS
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Nos；S10、将S9中得到的中间载体pGL
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35S
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MCS
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Nos用BglII/BamHI双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下3.97Kb大小的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到BglII/BamHI双酶切中间载体pGL
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35S
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MCS
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Nos的回收产物；S11、体外人工合成连接肽Linker正向引物和连接肽Linker反向引物，将所述连接肽Linker正向引物和所述连接肽Linker反向引物在温度为95℃的条件下退火5min，得到变性退火的连接肽Linker引物；所述连接肽Linker正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述连接肽Linker反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；S12、将S11中得到的变性退火的连接肽Linker引物T4连接至S10中得到的BglII/BamHI双酶切中间载体pGL
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35S
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MCS
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Nos的回收产物中pGL
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35S
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MCS
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Nos的BglII/BamHI位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pGL
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35S
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MCS
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Linker

【专利技术属性】
技术研发人员：徐玉芳，姚文，李涛，张会勇，林楠，孙玉慧，连红梅，贾利华，李阳，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：