一种基于补血效应的当归质量评价方法技术

本发明专利技术公开了一种基于补血效应的当归质量评价方法，包括：（1）将当归的干燥提取物配制成三种不同浓度的溶液，作为待测药物溶液，并控制其药效成分的含量低于安全浓度；（2）配制不同浓度的阿魏酸标准品浓度；（3）将K562细胞用专用培养基，传代培养至规定浓度；（4）将不同浓度待测药物溶液和阿魏酸标准品溶液分别给药细胞，培养一段时间后测定血红蛋白相对含量，以各实验组的血红蛋白相对含量为实验检测指标计算待测样品补血效应因子，并以此评价当归质量。本发明专利技术可以从当归的补血药效的角度，评价当归的质量，具有与疗效直接挂钩的特点，同时，该方法可以同时测定多份待测样品，具有高通量的特点。高通量的特点。高通量的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于补血效应的当归质量评价方法


[0001]本专利技术属于中药质量和生物效应评价领域，特别提供以补血效应作为评价指标的当归质量评价方法。

技术介绍

[0002]当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，具有补血活血的功效，是补血要药，用于血虚萎黄，眩晕心悸等病症。
[0003]目前，当归质量评价的方法主要从外观性状或化学成分方面着手，如薄层色谱法、显微鉴别、高效液相色谱法，近年还创新开发出指纹图谱鉴定等方法，但这些方法与当归的疗效相关性较弱；而关于当归补血生物效应评价方法，尚属空白，这是因为常用的整体动物生物效应检测方法虽然具有模型成熟、指标明确等优势，但是普遍成本较高、操作复杂、稳定性低，作为质量评价方法便捷性、普适性较低；体外细胞生物效应检测方法，可以弥补以上整体动物实验的诸多不足，还可以解决检测样本缺乏等问题，实现多批次同时检测，但此类方法尚未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种通过测定补血效应来评价当归质量的方法。
[0005]本专利技术技术方案如下：
[0006]一种基于补血效应的当归质量评价方法，包括如下步骤：
[0007](1)将当归的干燥提取物配制成三种不同浓度的溶液，作为待测药物溶液，并控制其药效成分的含量低于安全浓度，所述药效成分包括阿魏酸，相邻剂量组浓度比值r相等；
[0008](2)配制三种不同浓度的阿魏酸标准品溶液，相邻剂量组浓度比值＝r；
[0009](3)取K562细胞在专用培养基上传代培养至一定细胞浓度；
[0010](4)将不同浓度待测药物溶液和阿魏酸标准品溶液分别给药细胞，培养一段时间后测定血红蛋白相对含量，基于下式计算待测样品补血效应因子P
T
，作为当归质量的评价指标；
[0011][0012]其中，T1、T2、T3分别为高、中、低剂量组当归溶液血红蛋白相对含量；S1、S2、S3分别为高、中、低剂量组标准品溶液血红蛋白相对含量。
[0013]作为一种优选的实施方式，1＜r≤2。相邻剂量组浓度比值大于2或差值过大极易引起实验结果大幅跳跃，从而导致补血效应的剂量依赖性不明显或不成立，无法进行后续计算。将相邻剂量组浓度比值限制于1<r≤2，可以有效探究当归待测药物与其血红蛋白相对含量之间的关系，提升数据可靠性。
[0014]作为一种优选的实施方式，取K562细胞在专用培养基中传代培养至浓度为0.5～5
×
106个细胞/mL。一般的体外细胞实验中，接板时的细胞密度对实验成功与否至关重要。细
胞密度过高时，在有限体积和有限培养基环境中，会极大程度地限制细胞的生长；且培养后期极有可能因为细胞数量过高、营养不足或代谢物过多，导致细胞破碎、变形等一系列不利影响。细胞密度过低时，由于悬浮细胞特性需要聚集生长，细胞分散于培养基中，无法聚集，最终导致细胞生长缓慢，分化不明显，实验无法进行，0.5～5
×
106个细胞/mL为可获得有效实验结果的最佳范围。
[0015]作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中，高剂量组溶液中阿魏酸含量＜24μg/mL，当归多糖含量＜35μg/mL，藁本内酯含量＜250μg/mL。
[0016]作为一种优选的实施方式，所述步骤(2)中，高剂量组溶液浓度为10～24μg/mL。
[0017]作为一种优选的实施方式，所述步骤(3)中，K562细胞在添加富马酸铁、琥珀酸亚铁或氯化血红素的RPMI 1640培养基中培养。富马酸铁、琥珀酸亚铁或氯化血红素浓度根据其各自的毒性试验结果确定，添加的富马酸铁、琥珀酸亚铁或氯化血红素浓度应尽量避免对细胞的毒性作用。
[0018]作为一种优选的实施方式，给药细胞培养4～8天后测定血红蛋白相对含量。
[0019]作为一种优选的实施方式，所述步骤(3)中，所述血红蛋白相对含量指待测组相对于空白组的血红蛋白相对值，其计算方式如下：
[0020]血红蛋白相对含量(％)＝[A(实验组)
‑
A(无细胞组)]/[A(空白组)
‑
A(无细胞组)]*100％
[0021]其中，A表示联苯胺染色法酶标仪570nm处检测所得OD值，无细胞组仅为培养液，空白组含有细胞和培养液，实验组包括细胞、培养液及待测药物溶液/标准品溶液。
[0022]相对值不使用计量单位，使用相对值作为实验检测指标，含义明确、计算简单。
[0023]作为一种优选的实施方式，所述当归的干燥提取物的制备方法为：
[0024]取待测当归原料，加水后浸泡t1时间；之后武火煮沸，文火使其保持沸腾，煎煮t2时间后倒出煎液，再次加入等量水，重复煎煮过程；煎煮共三次，每次t2时间，合并煎液；将上述煎液预冷后，用冻干机冷冻干燥，即得当归的干燥提取物。
[0025]作为一种优选的实施方式，所述依据P
T
评价当归质量的方法为：
[0026]当归分为一等、二等、三等、统货四个等级，其中补血效应因子P
T
≥2.5为一等，2.5＞P
T
≥2为二等，2＞P
T
≥1.5为三等，1.5＞P
T
≥1为统货。
[0027]本专利技术基于实验确定的理论基础，改善当归质量控制以成分或性状为指标的现状，提供一种生物活性层面的当归质量评价方法，可与疗效直接挂钩，此外，该方法可以同时测定多份待测样品，具有高通量的特点，为进一步完善当归质量标准体系提供科学依据。
附图说明
[0028]图1是当归成分促进红系分化的流式细胞图。
[0029]图2是当归身实施结果图示。
具体实施方式
[0030]下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为
可以通过市售购买获得的常规产品。
[0031]实施例1
[0032]研究前期使用普通培养基进行实验，将当归待测物作用于K562细胞，培养后按照联苯胺染色法检测血红蛋白，发现其相对含量几乎无变化。经查阅文献，推测当归直接作用于体外培养的K562细胞，不能激活红系分化，需加入含铁试剂为体外造血微环境补充铁元素。因此选用加入富马酸铁、琥珀酸亚铁或氯化血红素的RPMI 1640专用培养基，重复上述实验。结果发现，在专用培养基培养环境中，当归待测物作用于体外培养的K562细胞中，可以诱导分化产生血红蛋白。基于此，实验基于毒性试验探究了含铁试剂的选择及其最佳作用浓度。
[0033]当归补血作用主要体现在促进血液中红细胞生成，本专利技术基于体外诱导多能干细胞定向红系分化，测定当归补血生物效价因子，评价当归质量。前期物质基础研究中，当归待测物作用于K562本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于补血效应的当归质量评价方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将当归的干燥提取物配制成三种不同浓度的溶液，作为待测药物溶液，并控制其药效成分的含量低于安全浓度，所述药效成分包括阿魏酸，相邻剂量组浓度比值r相等；(2)配制三种不同浓度的阿魏酸标准品溶液，相邻剂量组浓度比值＝r；(3)取K562细胞在专用培养基上传代培养至一定细胞浓度；(4)将不同浓度待测药物溶液和阿魏酸标准品溶液分别给药细胞，培养一段时间后测定血红蛋白相对含量，基于下式计算待测样品补血效应因子P
T
，并以此评价当归质量；其中，T1、T2、T3分别为高、中、低剂量组当归溶液血红蛋白相对含量；S1、S2、S3分别为高、中、低剂量组标准品溶液血红蛋白相对含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，1＜r≤2。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，取K562细胞在专用培养基中传代培养至浓度为0.5～5
×
106个细胞/mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，高剂量组溶液中阿魏酸含量＜24μg/mL，当归多糖含量＜35μg/mL，藁本内酯含量＜250μg/mL。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，高剂量组溶液浓度为10～24μg/mL。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，K562细胞在添加富马酸铁、琥珀酸亚铁或氯化血红...

【专利技术属性】
技术研发人员：李林，刘欢欢，殷放宙，毛春芹，陆兔林，季德，苏联麟，张婷，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：