一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法技术

本发明专利技术涉及一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法，包括以下步骤：（1）构建沉默表达载体，获得含2mDNA1

【技术实现步骤摘要】
一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法


[0001]本专利技术涉及农业昆虫与害虫防治，具体是涉及一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法，即沉默烟粉虱类胡萝卜素合成基因影响烟粉虱趋黄性的方法。

技术介绍

[0002]烟粉虱为半翅目、粉虱科、小粉虱属的一类体型微小的昆虫。随着全球贸易的迅速发展，烟粉虱在全球范围内广泛传播，为害蔬菜、花卉等经济作物以及木薯、甘薯等粮食作物，烟粉虱在成虫期和若虫期均可危害寄主植物，在世界范围内造成重大的经济损失。
[0003]目前在生产实际中对于烟粉虱的防治主要依赖于化学药剂防控，但由于化学农药的滥用及使用不规范，粉虱的抗药性问题日趋严重，加大了粉虱的防治难度。同时化学农药的过度使用造成了许多不良后果，如对农产品使用者和消费者的健康构成风险及对非目标生物造成损害等。为解决化学药剂的大量使用对粉虱抗药性以及对生态环境的影响，需要进一步探索新型防治措施。
[0004]昆虫感受光的本质是视觉色素吸收光子，将吸收的光学信号转化为电信号后在昆虫体内传导。视觉色素分子包含视蛋白，是G蛋白的偶联受体，结构通常为11
‑
顺式视黄醛（维生素A），类胡萝卜素是合成维生素A的前体物质，与昆虫的视觉能力存在密切关系。视觉信号在昆虫定位寄主植物，寻找配偶和产卵过程中起着至关重要的作用。因此，通过干扰昆虫的视觉能力，可为害虫的无公害防治提供理论基础，但目前还没有基于影响粉虱视觉能力对其进行防治的方法。

技术实现思路

[0005]为探索新型防治方法，本专利技术的目的是提出一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法，沉默类胡萝卜素合成基因从而影响粉虱趋黄性，即通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）方法，沉默烟粉虱类胡萝卜素合成基因，干扰粉虱的视觉能力而达到防治粉虱的目的。
[0006]本方案目的是通过以下技术方案实现的：一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法，其技术要点是：包括以下步骤：（1）构建沉默表达载体
①ꢀ
获取粉虱基因靶标片段BtGGPS1的PCR纯化产物；
②ꢀ
所述基因靶标片段BtGGPS1的PCR纯化产物、2mDNA1载体分别进行双酶切，获得含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因GGPS1片段、2mDNA1载体片段；
③
所述含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因GGPS1片段与2mDNA1载体片段连接，获得2mDNA1
‑
GGPS1连接产物；
④ꢀ
所述2mDNA1
‑
GGPS1连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌DH5α；热击处理后进行2mDNA1特异性检测，获得2mDNA1
‑
GGPS1重组沉默表达载体，浓度调整为30
‑
40 ng/μL；
⑤ꢀ
所述2mDNA1
‑
GGPS1重组沉默表达载体电击转化EHA105农杆菌感受态细胞；获得含2mDNA1
‑
GGPS1沉默表达载体的农杆菌；
（2）所述含2mDNA1
‑
GGPS1沉默表达载体的农杆菌按照农杆菌侵染法接种健康植株后，通过2mDNA1特异性检测，获得携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株；（3）在携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株上饲养粉虱；获得具有2mDNA1
‑
GGPS1沉默表达载体的粉虱，所述2mDNA1
‑
GGPS1沉默表达载体的粉虱的类胡萝卜素合成基因GGPS1表达被抑制、类胡萝卜素含量降低。
[0007]进一步的，所述类胡萝卜素合成基因沉默方法用于降低粉虱趋黄性，影响粉虱视觉。
[0008]进一步的，所述粉虱类胡萝卜素基因沉默体系适用于烟粉虱、温室白粉虱。
[0009]进一步的，所述粉虱基因靶标片段BtGGPS1具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述粉虱基因靶标片段BtGGPS1获取的方法为：以粉虱cDNA为模板，用引入了BamHI和XbaI两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物，扩增目的基因有效片段；所述BamHI和XbaI两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物为p
‑
GGPS1
‑
F和p
‑
GGPS1
‑
R，所述p
‑
GGPS1
‑
F具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述p
‑
GGPS1
‑
R具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；所述靶标基因片段长度为100
‑
1000 bp，测序验证后用Promega公司的纯化试剂盒纯化，获得靶标片段GGPS1的PCR纯化产物。
[0010]进一步的，所述靶标片段GGPS1的PCR纯化产物、2mDNA1载体双酶切均采用Takara 公司的QuickCut限制性内切酶试剂盒；反应条件均为：30℃，1hour；37℃，1hour；70℃，10min使酶失活。
[0011]进一步的，所述含有BamHI和XbaI粘性末端的GGPS1靶标基因片段和2mDNA1载体片段连接采用T4 DNA Ligase试剂盒，把靶标基因GGPS1片段：2mDNA1载体片段体积比为2.5 μL：0.5 μL，混匀后4℃过夜连接，获得2mDNA1
‑
GGPS1连接产物。
[0012]进一步的，所述2mDNA1特异性检测的引物为DNA1F和DNA1R ，所述DNA1F具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，所述DNA1R具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
[0013]进一步的，所述步骤（3）中，所述粉虱为烟粉虱，所述VIGS植株为VIGS番茄植株；所述在携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株上饲养粉虱的方法为：取羽化1d的烟粉虱，在VIGS番茄植株上饲喂13 d，获得2mDNA1
‑ꢀ
GGPS1沉默表达载体的烟粉虱。
[0014]本专利技术的有益效果：本方法通过粉虱取食VIGS植株后类胡萝卜素合成基因GGPS1表达被抑制，其体内类胡萝卜素含量显著下降，影响了粉虱的视觉能力，趋黄性受到显著影响；同时粉虱死亡率显著上升，产卵量显著下降，种群数量被显著抑制，起到粉虱防治的作用。
附图说明
[0015]图1 为羽化1 d烟粉虱取食携带2mDNA1沉默载体的VIGS番茄13 d后类胡萝卜素合成基因表达情况，图中2mDNA1
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control为取食携带2mDNA1空载体番茄的烟粉虱；所述2mDNA1
‑
GGPS1为取食携带2mDNA1
‑
GGPS1番茄的烟粉虱；图2为羽化1 d烟粉虱取食携带2mDNA1沉默载体的VIGS番茄13 d后类胡萝卜素含量变化，图中2mDNA1
‑
control为取食携带2mDNA1空载体番茄的烟粉虱，所述2mDNA1
‑
GGPS1为取食携带2mDNA1
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法，其特征是：包括以下步骤：（1）构建沉默表达载体
①ꢀ
获取粉虱基因靶标片段BtGGPS1的PCR纯化产物；
②ꢀ
所述基因靶标片段BtGGPS1的PCR纯化产物、2mDNA1载体分别进行双酶切，获得含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因GGPS1片段、2mDNA1载体片段；
③
所述含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因GGPS1片段与2mDNA1载体片段连接，获得2mDNA1
‑
GGPS1连接产物；
④ꢀ
所述2mDNA1
‑
GGPS1连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌DH5α；热击处理后进行2mDNA1特异性检测，获得2mDNA1
‑
GGPS1重组沉默表达载体，浓度调整为30
‑
40 ng/μL；
⑤ꢀ
所述2mDNA1
‑
GGPS1重组沉默表达载体电击转化EHA105农杆菌感受态细胞；获得含2mDNA1
‑
GGPS1沉默表达载体的农杆菌；（2）所述含2mDNA1
‑
GGPS1沉默表达载体的农杆菌按照农杆菌侵染法接种健康植株后，通过2mDNA1特异性检测，获得携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株；（3）在携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株上饲养粉虱；获得具有2mDNA1
‑
GGPS1沉默表达载体的粉虱，所述2mDNA1
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GGPS1沉默表达载体的粉虱的类胡萝卜素合成基因GGPS1表达被抑制、类胡萝卜素含量降低。2.根据权利要求1所述的一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法，其特征是：所述类胡萝卜素合成基因沉默方法用于降低粉虱趋黄性，影响粉虱视觉。3.根据权利要求1所述的一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法，其特征是：所述粉虱类胡萝卜素基因沉默体系适用于烟粉虱、温室白粉虱。4.根据权利要求1所述的一种粉虱类胡萝卜素合成基因沉默方法，其特征是：所述粉虱基因靶标片段BtGGPS1具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述粉虱基因靶标片段BtGGPS1...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄艳贞，栾军波，卢月，王天玉，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：