一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的方法及应用技术

本发明专利技术提供一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的方法，包括：1)以桔小实蝇线粒体COI基因中的含有多态性变异位点的区段为靶基因，设计特异性LAMP引物组；2)利用所述特异性LAMP引物组，以待测样本的全基因组DNA为底物，进行LAMP反应；3)所述LAMP反应结束后，根据检测用核酸染料的显色结果判断待测样本是否为桔小实蝇。本发明专利技术还提供了相应的引物组及应用。本发明专利技术提供的方法和引物组能够在73个果实蝇属的物种中精确检测桔小实蝇，且具有高灵敏性，可用于生物检疫中对检材的可视化快速检验。可用于生物检疫中对检材的可视化快速检验。可用于生物检疫中对检材的可视化快速检验。

【技术实现步骤摘要】
一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物检疫
，具体涉及一种基于可视化LAMP 技术检测桔小实蝇的方法及应用。

技术介绍

[0002]实蝇科(Tephritidae)中许多种类具有重要经济影响，不但给发生 地区的水果和蔬菜生产造成重大损失，而且还严重影响着我国水果和 蔬菜的对外出口贸易。桔小实蝇属双翅目(Diptera)实蝇科 (Tephritidae)，广泛分布在亚洲南部、东南部和南太平洋的热带温带 地区。根据已有报道，桔小实蝇对46科的250多种植物的果实产生 危害，尚未见于报道的实际产生危害的果蔬种类更多。由于其危害巨 大，并且容易随寄主果实的调运从而远距离传播，从而严重影响了果 蔬生产和国际贸易，我国和许多国家及地区将其列为重要的进境植物 的检疫性有害生物。
[0003]长期以来，实蝇的鉴定主要是基于其形态特征而确定的，由于生 活环境不同，实蝇形态特征会随之发生相应的变化，给鉴定带来困难。 而且，在瓜果蔬菜的检疫过程中，检测到的通常是果蔬携带的实蝇幼 虫，通过传统形态学法很难对实蝇幼虫进行准确鉴定，这给实蝇的检 疫防控带来困难。
[0004]目前，虽然有一些现有技术提供了针对个别实蝇种别的鉴定方法， 例如，申请号为201410178620.4的中国专利申请公开了一种将针对 多种生物的引物组混合使用的环介导等温扩增检测方法，但该专利技 术仅针对辣椒实蝇、瓜实蝇、番石榴实蝇和桃实蝇设计混合引物用于 鉴别上述5种实蝇，没有涉及桔小实蝇的特异引物，不能用于检测桔 小实蝇。当前，对于桔小实蝇分子检测的方法主要是基于聚合酶链式 反应(PCR)的技术或实时荧光定量(Real
‑
time PCR)进行的，均存 在试验周期较长、操作繁琐、受检测材料限制、对实验仪器及检测人 员的技术要求高等缺点，因此难以满足基层实验室的检测需求。
[0005]等温扩增技术即环介导等温扩增法(loop
‑
mediated isothermalamplification，LAMP)，是2000年Notomi等开发的一种新的核酸等 温扩增方法。LAMP具有操作简单、快速、灵敏度高等优点，已广 泛应用于病毒、细菌、线虫等鉴定领域。LAMP技术具有如下特点； 1)灵敏度和特异性高：检出限仅为几个拷贝，与pcr相比高出几个数 量级。利用外引物和内引物与目的片段6个特异性部位准确结合发生 扩增反应，只有当引物与目的片段6个区域都匹配时才进行扩增；2) 检测速度快、扩增效率高：LAMP是恒温扩增反应，比PCR用时短， 60分钟内完成基本反应并检测扩增产物。加入环引物后，可缩短反 应时间至30分钟。通过链取代并形成不同环结构而大量扩增，促使 目的基因在反应时间内连续进行指数扩增，扩增数量高于PCR上千 倍；3)设备简单、操作简便：只需要如水浴锅、金属浴等恒温器即 可完成此实验，不需要购置昂贵的PCR仪，易于推广应用；4)产物 易检测：根据LAMP反应特性，判断产物结果的方法有琼脂糖凝胶 电泳检测法、浊度检测法和荧光比色检测法等。LAMP反应过程中产 生多种片段的扩增产物，其在电泳中会形成特异性的梯状条带，此为 电泳检测法。由于LAMP反应过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀，通 过实时浊度计检测反
应过程中焦磷酸镁沉淀产生的浊度实现定量检 测。通过SYBR green I、钙黄绿素(Calcein)荧光染料的颜色变化来 定性判断靶序列扩增与否，阳性为绿色，阴性为橙色，此为荧光比色 检测法。虽然，在申请号为201711141240.3的中国专利申请中公开 了一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法，但是该专利是通过LAMP 技术来鉴定瓜实蝇，也不能用于桔小实蝇检测。因此，如何对桔小实 蝇进行精准、快速检测的问题仍然亟需解决。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过桔小实蝇的LAMP检测技术研究，开发了一套基于LAMP的桔小实蝇可视化快速分子检测技术，可有效解决幼虫鉴定 周期长的难题。
[0007]本专利技术首先提供了一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的 方法，，包括：
[0008]1)以桔小实蝇线粒体COI基因中的含有多态性变异位点的区段 为靶基因，设计特异性LAMP引物组；
[0009]2)利用所述特异性LAMP引物组，以待测样本的全基因组DNA 为底物，进行LAMP反应；
[0010]3)所述LAMP反应结束后，根据检测用核酸染料的显色结果判 断待测样本是否为桔小实蝇。
[0011]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述靶基因的核苷酸序列为 SEQ ID NO:1。
[0012]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述特异性LAMP引物组由 核苷酸序列为SEQ ID NO:2的F3引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:3 的B3引物，核苷酸序列为SEQ ID NO:4的FIP引物，以及核苷酸序 列为SEQ ID NO:5的BIP引物组成。
[0013]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述LAMP反应的条件为： 63℃40
‑
60min，85℃灭活5min。
[0014]在根据本专利技术的一个实施方案中，应体系中聚合酶为Bst DNA 大片段聚合酶。
[0015]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述检测用核酸染料为钙黄绿 素或SYBR Green I，优选为SYBR Green I。
[0016]更优选地，所述方法还包括：反应体系配置好之后于试管内壁上 层设置一不与反应体系接触的隔膜，并将适量核酸染料(SYBR GreenI)滴加在隔膜上，然后盖好盖子进行反应，在反应结束后通过离心 使核酸染料混进体系中。所述隔膜优选为锡箔或铝箔。上述操作实现 免开盖显色的操作，避免了操作中产生交叉污染的问题。
[0017]本专利技术的同时还提供了一种用于可视化检测桔小实蝇的LAMP 引物组，由核苷酸序列为SEQ ID NO:2的F3引物、核苷酸序列为SEQID NO:3的B3引物，核苷酸序列为SEQ ID NO:4的FIP引物，以及 核苷酸序列为SEQ ID NO:5的BIP引物组成。
[0018]本专利技术的另一方面提供了一种用于可视化检测桔小实蝇的试剂 盒，包含上述的引物组的试剂，以及检测用核酸染料，优选地，所述 检测用核酸染料为SYBR Green I。
[0019]本专利技术还提供了上述的方法、LAMP引物组、或者试剂盒在生物 检疫中的应用。
[0020]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述生物检疫中以实蝇幼虫或 实蝇成虫为生物检材。
[0021]本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：
[0022]上述方案中，解决了桔小实蝇幼虫难以鉴别的问题，用快速分子 检测加可视化方
法，可以在1小时内获得检测结果。免开盖的可视化 检测方法可以有效避免气溶胶污染，能够准确显色。不需要昂贵的仪 器设备，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单， 直接肉眼观察绿色荧光即可，不像普通P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的方法，其特征在于，包括：1)以桔小实蝇线粒体COI基因中的含有多态性变异位点的区段为靶基因，设计特异性LAMP引物组；2)利用所述特异性LAMP引物组，以待测样本的全基因组DNA为底物，进行LAMP反应；3)所述LAMP反应结束后，根据检测用核酸染料的显色结果判断待测样本是否为桔小实蝇。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性LAMP引物组由核苷酸序列为SEQ ID NO:2的F3引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:3的B3引物，核苷酸序列为SEQ ID NO:4的FIP引物，以及核苷酸序列为SEQ ID NO:5的BIP引物组成。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LAMP反应的条件为：63℃40
‑
60min，85℃灭活5min。5.如权利要求1所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：董兆克，褚栋，刘利君，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：