宣肺败毒方的新用途及分析方法技术

本发明专利技术提供了宣肺败毒方在制备肠道菌群调节药物方面的新用途，通过对宣肺败毒方干预28天的大鼠肠道微生物组和靶向代谢组进行了系统分析，首次发现组间共有14个菌属在统计学上具有显著差异。上具有显著差异。上具有显著差异。

【技术实现步骤摘要】
宣肺败毒方的新用途及分析方法


[0001]本专利技术涉及医药生物
，尤其是涉及宣肺败毒方的新用途及分析方法。

技术介绍

[0002]人体的健康与肠道内的微生物群落结构息息相关，肠道微生物群在参与疾病的治疗以及在疾病的发生发展中起到重要作用，人体内的肠道菌群是一个复杂的微生态系统，大约含有10
14
个微生物，在机体内参与能量摄入、新陈代谢以及免疫调节等多种生理功能，肠道微生物群的比例对于维持机体内肠道稳态平衡起着至关重要的作用。大量研究证实肠道菌群的调控是中药复方发挥药效的重要途径，作为肠道菌群发酵膳食纤维、碳水化合物以及其它物质等产生的代谢物质，短链脂肪酸主要由碳原子数目为1
‑
6个的饱和脂肪酸组成，是肠道菌群与宿主之间重要的信号分子，在调节机体代谢、维持机体免疫稳态以及调节炎症等方面产生一定影响，一定程度上可维持宿主肠道内稳态，改善肠道健康。
[0003]宣肺败毒方是《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》试行第六、七版中针对新冠肺炎普通型湿毒郁肺证患者的推荐方剂，由13味中药组成，是在麻杏石甘汤等四种经典名方的基础上经过组合优化和药味加减而制，临床上用于治疗轻型及普通型新冠肺炎患者，疗效显著，由于该方药味组成丰富，化学成分复杂，其药效物质基础及作用机制尚不明确，且到目前为止针对该方的研究还不是很广泛，有待深入研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种宣肺败毒方的新用途。
[0005]本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述宣肺败毒方用途的分析方法。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：
[0007]宣肺败毒方在制备肠道菌群调节药物方面的新用途。
[0008]优选的，上述宣肺败毒方的新用途，所述菌群为普雷沃氏菌属、脱硫弧菌属、帕拉普氏菌属、臭杆菌、类芽孢八叠球菌属、CF231、YRC22及丁酸弧菌属(Butyricimonas属)、布劳特氏菌属、别样棒菌属、考拉杆菌属、多尔氏菌属、双歧杆菌属和/或柯林斯菌属。
[0009]一种用于测定上述宣肺败毒方用途的分析方法，基于16S rDNA基因测序技术对宣肺败毒方干预正常大鼠的肠道微生物组成、功能差异进行分析，步骤如下：
[0010](1)粪便样本基因组DNA提取
[0011]采用CTAB法提取总基因组DNA，在1％琼脂糖凝胶上检测DNA浓度和纯度。根据浓度，用无菌水稀释DNA至1ng/μL；
[0012](2)目标片段PCR扩增及产物纯化
[0013]使用515F(5
’‑
ACTCCTACGGGAGGCAGCA
‑3’
)和806R(5
’‑
GGACTACHVGGGTWTCTAAT
‑3’
)引物扩增16S rDNA基因的V3
‑
V4区，扩增片段大小为500bp，利用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen,Germany)回收PCR产物纯化；
[0014](3)扩增产物荧光定量
[0015]将等量的1X电泳上样缓冲液(包含SYB green荧光染料)与PCR产物混合，在2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，PCR产物以等密度比例混合，所采用的荧光试剂为Quant
‑
iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader(BioTek,FLx800)；
[0016](4)测序文库制备
[0017]采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库；
[0018](5)高通量测序
[0019]利用Illumina公司的NovaSeqPE250测序仪进行高通量测序；
[0020](7)数据处理与统计分析
[0021]根据QIIME质量控制程序，在特定的过滤条件下对原始标签进行质量过滤。使用FLASH对序列进行拼接，将标签与Silva数据库并使用UCHIME算法进行比较检测嵌合体序列进而得到有效标签。使用Uparse软件根据97％的相似度对序列进行OTU聚类分析，并基于Mothur算法使用Silva数据库对分类信息进行注释。根据序列获得的最少序列的样本进行抽平，分析大鼠盲肠内容物中微生物群落的多样性和丰富度，基于物种注释结果，对组间不同分类水平上的物种组成进行比较，然后再采用PCoA分析方法比较各组微生物群落的差异，采用LEfSe差异判别分析方法，筛选出组间具有显著差异的标志物种。通过Kruskal
‑
Wallis秩和检验和dunn
’
test作为事后检验来验证Alpha多样性差异的显著性，采用Kruskal
‑
Wallis以及Wilcoxon秩和检验方法并结合P值来筛选差异微生物，P<0.05被认为具有显著性差异。
[0022]优选的，上述分析方法，为短链脂肪酸的分析方法，基于GC
‑
MS/MS技术对宣肺败毒方干预正常大鼠粪便中短链脂肪酸(SCFAs)的含量测定，步骤如下：
[0023](1)样品的制备
[0024]称取适量粪便样本于EP管中，加入磷酸以及钢珠，然后均质并涡旋，之后在冰浴下超声，离心，然后取上清液于离心管中，再加入含内标的MTBE溶液，涡旋，冰浴超声，离心，取上清，
‑
20℃冰箱保存，待GC
‑
MS/MS分析；
[0025](2)气相色谱
‑
质谱条件
[0026]气相色谱
‑
质谱条件：Agilent 7890B气相色谱仪与配备DB
‑
FFAP色谱柱(30m*0.25mm*0.25μm)的7000D质谱仪联用，以氦气作为载气，分流模式1：1，柱流速为1.2mL
·
min
‑1，柱箱升温程序为90℃保持1min，以25℃/min升至100℃，以20℃/min升至150℃，以25℃/min升至200℃，保持0.5min，后运行3min；进样量为2μL，前进样口温度200℃，传输线温度230℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，所有样品均在多反应监测模式下进行分析；
[0027](3)对照品溶液的配制及标准曲线的建立
[0028]配制不同浓度的标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据，以外标与内标浓度比(Concentration Ratio)为横坐标，外标与内标峰面积比(Area Ratio)为纵坐标，绘制不同物质的标准曲线；
[0029](4)方法学考察
[0030]1)精密度：
[0031]日内精密度：准备低高两个浓度的混标样品，每个浓度5份，在气相色谱
‑
质谱条件下，连续进样6次，对各成分的峰面积进行积分，计算各峰面积的相对标准偏差本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.宣肺败毒方在制备肠道菌群调节药物方面的新用途。2.根据权利要求1所述的宣肺败毒方的新用途，其特征在于：所述菌群为普雷沃氏菌属、脱硫弧菌属、帕拉普氏菌属、臭杆菌、类芽孢八叠球菌属、CF231属、YRC22属、丁酸弧菌属、布劳特氏菌属、别样棒菌属、考拉杆菌属、多尔氏菌属、双歧杆菌属和/或柯林斯菌属。3.一种用于测定权利要求1所述宣肺败毒方用途的分析方法，其特征在于：基于16S rDNA基因测序技术对宣肺败毒方干预正常大鼠的肠道微生物组成、功能差异进行分析，步骤如下：(1)粪便样本基因组DNA提取采用CTAB法提取总基因组DNA，在1％琼脂糖凝胶上检测DNA浓度和纯度。根据浓度，用无菌水稀释DNA至1ng/μL；(2)目标片段PCR扩增及产物纯化使用515F和806R引物扩增16S rDNA基因的V3
‑
V4区，扩增片段大小为500bp，利用Qiagen Gel Extraction Kit回收PCR产物纯化；(3)扩增产物荧光定量将等量的1X电泳上样包含荧光染料的缓冲液与PCR产物混合，在2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，PCR产物以等密度比例混合；(4)测序文库制备采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库；(5)高通量测序利用Illumina公司的NovaSeqPE250测序仪进行高通量测序；(6)数据处理与统计分析根据QIIME质量控制程序，在特定的过滤条件下对原始标签进行质量过滤。使用FLASH对序列进行拼接，将标签与Silva数据库并使用UCHIME算法进行比较检测嵌合体序列进而得到有效标签。使用Uparse软件根据97％的相似度对序列进行OTU聚类分析，并基于Mothur算法使用Silva数据库对分类信息进行注释。根据序列获得的最少序列的样本进行抽平，分析大鼠盲肠内容物中微生物群落的多样性和丰富度，基于物种注释结果，对组间不同分类水平上的物种组成进行比较，然后再采用PCoA分析方法比较各组微生物群落的差异，采用LEfSe差异判别分析方法，筛选出组间具有显著差异的标志物种。通过Kruskal
‑
Wallis秩和检验和dunn
’
test作为事后检验来验证Alpha多样性差异的显著性，采用Kruskal
‑
Wallis以及Wilcoxon秩和检验方法并结合P值来筛选差异微生物，P<0.05被认为具有显著性差异。4.根据权利要求3所述的分析方法，为短链脂肪酸的分析方法，其特征在于：基于GC
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MS/MS技术对宣肺败毒方干预正常大鼠粪便中短链脂肪酸的含量测定，步骤如下：(1)样品的制备称取适量粪便样本于EP管中，加入磷酸以及钢珠，然后均质并涡旋，之后在冰浴下超声，离心，然后取上清液...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓鹏，何巧玉，李春霞，刘静，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：