用于梨品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于梨品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用，所述MNP标记位点为在梨基因组上筛选的在梨种群内具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括梨基因组GCA_000315295.1上MNP

【技术实现步骤摘要】
用于梨品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用


[0001]本专利技术实施例涉及生物
，特别涉及一种用于梨品种鉴定的MNP标记位点、引 物组合物和试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]利用分子标记技术对品种间DNA水平上的多态性信息进行统计分析，可较为全面地掌 握种质资源的遗传多样性和遗传变异水平，因此广泛运用于植物品种鉴定中。目前广泛应 用的分子标记类型有SSR(Simple Sequence Repeats)标记和SNP(Single NucleotidePolymorphism)标记。SSR标记包含一段简单重复序列，其突出优势是多态性高，但SSR 标记法一次PCR扩增一般不超过5个SSR位点，通量低，DNA聚合酶在扩增SSR位点时， 存在滑动现象，容易产生不真实的滑脱基因型，滑脱基因型与样本中主基因型区分不开， 导致SSR标记法难以用于多倍体植物的鉴定。全基因组重测序技术可以一次可检测大量的 SSR位点，但基因组上仅～3％的序列为SSR位点，导致检测成本较高。因此，实际应用中 往往只能检测有限的SSR位点，无法满足实质性派生品种鉴定对标记数量的要求。基因芯 片法可以一次可检测成千上万、甚至几十万个SNP位点，通量大大高于SSR标记。然而， 一个SNP标记位点仅有2种等位基因型，多态性远低于SSR标记，难以区分多倍体植株； 检测SNP标记的探针固定在芯片上，芯片一旦合成，很难调整与改变，灵活性差。
[0003]目前梨缺乏品种真实性鉴定的标准，虽然少数研究论文发表了利用SSR标记在梨遗传 育种和遗传分析中的应用，但是标记位点数较少，区分度不高，如中国农业科学院郑州果 树研究所于2018年发表的论文“薛华柏等.梨品种SSR特征指纹图谱与分子身份证构建.中国 南方果树,2018,(第A1期)”，中用到了25个SSR位点，但这25个位点未能将“张掖长把”和
ꢀ“
兰州长把”，“巍山红雪梨1号”和“巍山红雪梨2号”，“火把梨"“晚熟火把梨”和“祥云火把梨”，
ꢀ“
弥渡小红梨”和“祥云小红梨”等4组共9个品种区分开。说明此类方法在鉴定梨品种真实性 中还存在局限，因此在实际应用中并未广泛采用。
[0004]因此，开发用于梨品种鉴定的高多态性的新型分子标记及其检测技术，成为亟待解决 的技术问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种用于梨品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应 用，不仅可以对梨品种进行品种真实性鉴定和实质性派生品种鉴定，也可以对梨品种进行 遗传分析，具有区分度强、通量高、准确度高的效果。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种用于梨品种鉴定的MNP标记位点，所述MNP标记 位点为在梨基因组上筛选的在梨种群内具有多个核苷酸多态性的基因组区域，所述MNP标 记位点包括梨基因组GCA_000315295.1上MNP
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1～MNP
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558的标记位点。
包括梨基因组GCA_000315295.1上MNP
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1～MNP
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558的标记位点。
[0036]接着，本专利技术设计出了扩增这些MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括558对引物，所述558对引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.1116所示。所述引物互相间不冲突，可以通过多重PCR进行高效的扩增，鉴定准确度高、结果重现性强，满足DNA指纹数据库构建的要求；
[0037]所述多重PCR引物组合物可以用于检测所述MNP标记位点的检测试剂盒。所述引物和检测试剂盒应用于梨品种真实性鉴定、实质性派生鉴定、种质资源遗传多样性分析以及其他相关领域中。
[0038]下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的一种用于梨品种鉴定的MNP标记位点、引物组合物和试剂盒及其应用进行详细说明。
[0039]实施例1、用于梨品种鉴定的MNP标记位点的筛选和多重PCR扩增引物的设计
[0040]S1、用于梨品种鉴定的MNP标记位点的筛选
[0041]对收集的苏翠1号、丰水、玉露香等15份梨品种进行简化基因组测序，每个样品获得20G的测序数据，以公开发布的梨基因组序列GCA_000315295.1为参考基因组，并结合从NCBI的SRA数据库中获得的113个梨样本的基因组测序数据，首先采用Samtools(Version1.2)和BCFtools(Version:1.2)进行序列分析获得梨基因组上的SNP位点，并与NCBI的NT库进行比较分析，按以下原则进行MNP标记的筛选：(1)标记序列仅在梨特有，不在其它物种中出现；(2)序列在基因组中单拷贝；(3)标记序列上有至少三个以上不连续SNP的差异；(4)标记序列长度小于250bp；进一步利用已测得的梨品种简化测序数据分析筛选出的候选MNP标记的区分度，最终筛选出如表1所示的558个MNP标记位点。
[0042]表1
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558个梨MNP标记位点以及558对检测引物在参考序列上的起始位置
[0043][0044][0045][0046][0047][0048][0049][0050][0051][0052][0053][0054][0055]S2、多重PCR扩增引物的设计
[0056]通过引物设计软件设计所述MNP位点的多重PCR扩增引物，引物设计遵循引物间互 不干扰，所有引物可以组合成引物池进行多重PCR扩增，即所有设计的引物可以在一个扩 增反应中均正常扩增，最终筛选出本专利技术表1所述的558个MNP位点的引物组合物。
[0057]实施例2、梨品种鉴定的MNP标记、引物组合物及其试剂盒的评估
[0058]558对引物合成后，每条引物取5ul/条的等量进行混合组成F和R端引物1:1混合的引 物mix。利用单位收集的44份梨品种进行开发的MNP标记、引物以及试剂盒的评估，测 试MNP标记位点的检出率、准确性和区分度。
[0059](1)MNP标记检出率
[0060]按本专利技术所述试剂盒进行多重PCR扩增及测序文库的构建，对这44份梨DNA样本进 行了多重扩增、二代高通量测序与数据分析，实现了一次实验达到558
×
44＝24552个标记 的检测，每个样品的测序平均覆盖倍数达750倍以上，显示了MNP标记检测的高效性。
[0061]梨MNP标记检出位点数分布图如图1所示，在这44个样本的测序数据中统计MNP标 记的检出数目，每个品种平均可以检出539个MNP标记，检出率达96.7％，表明检出标记 数量远超现有SSR标记数量，且检出率高。
[0062](2)梨MNP标记法准确性分析
[0063]为了检验梨MNP标记的准确性，对这44个梨品种按以下方法进行了重现性实验。用 每个品种的同一份DNA分别于不同时间构建2次文库，编号
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于梨品种鉴定的MNP标记位点，其特征在于，所述MNP标记位点为在梨基因组上筛选的在梨种群内具有多个核苷酸多态性的基因组区域，所述MNP标记位点包括梨基因组GCA_000315295.1上MNP
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1～MNP
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558的标记位点。2.一种用于检测权利要求1所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，其特征在于，所述多重PCR引物组合物包括558对引物，所述558对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.1116所示。3.一种用于检测权利要求1所述MNP标记位点的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物组合物。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重...

【专利技术属性】
技术研发人员：方治伟，李甜甜，彭海，周俊飞，高利芬，陈利红，李论，肖华锋，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：