一种制备可有效递送TGF-β1生长因子的透明质酸微凝胶的方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质负载领域，公开了一种制备可有效递送TGF

【技术实现步骤摘要】
一种制备可有效递送TGF
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β
1生长因子的透明质酸微凝胶的方法


[0001]本专利技术涉及一种蛋白质载体的制备方法，尤其涉及制备一种有效负载TGF
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β1的方法。

技术介绍

[0002]微凝胶可由合成和天然聚合物制成。多糖基微凝胶因其生物相容性、生物降解性和无免疫原性而受到广泛关注。分子链上羟基和羧基等官能团的存在为各种化学修饰提供了锚点。其中，透明质酸(HA)是一种存在于许多组织中的线性天然糖胺聚糖，由于其优异的生物相容性、生物可降解性和低免疫风险而被广泛研究。
[0003]TGF
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β1作为多功能细胞因子，可调节细胞增殖、生长、分化和活力，以及细胞外基质的合成和沉积。它们参与各种生理过程，包括胚胎生成、组织重塑和伤口愈合。它们主要作为潜伏复合物进行分泌，这些复合物储存在细胞表面和细胞外基质中。从潜在复合体中释放生物活性TGF
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β1等离子体涉及由血栓庞丁
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1等蛋白质对复合物进行蛋白质解质处理和/或诱导构造变化。
[0004]微凝胶可以用反相乳液技术制造。油包水凝胶化包括聚合物前体溶液在连续有机相中的乳化，随后水微滴的交联。通常，微凝胶的网络由物理或静电相互作用(如离子交联)或共价化学交联(如自由基反应)形成。而关于化学交联的一个主要问题是细胞毒性试剂的存在或暴露在苛刻的实验条件下，这可能会影响包封蛋白质的生物活性。而交联网络可以在温和的条件下在酶的存在下形成，如HRP和低浓度的H2O2。
[0005]因此，选用反相微乳液来和酶法制备HA
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TA微凝胶，在相对安全的条件下对TGF
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β1有效负载，对负载阳离子蛋白的研究尤为重要。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种制备可有效递送TGF
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β1的透明质酸微凝胶的方法，制备出一种新型可降解的蛋白载体，所述的蛋白质载体具有较高的负载率。该载体进行体外细胞毒性试验，植入人间充质干细胞(hMSCs)数天，发现培养的hMSC的代谢活性并未发生显著变化。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种制备可有效递送TGF
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β1的透明质酸微凝胶的方法，包括以下步骤：
[0007](1)透明质酸钠的活化
[0008]将1g分子量为25kDa(含2.5mmol COOH基团)的透明质酸钠溶解在30mL的PBS中。加入1.0g EDAC和1.3g NHS，并将溶液搅拌2h。将产物在冷乙醇中沉淀、过滤，先后用乙醇、乙醚进行洗涤。
[0009](2)透明质酸酪胺(HA
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TA)的合成
[0010]将1.0g具有NHS活化的COOH基团的聚合物溶解在30mLpH 6.1MES缓冲液中。后将385mg酪胺溶解在4mL二甲基甲酰胺中，并加入溶液中。搅拌过夜，将所得溶液在冷乙醇中沉
淀、过滤，并分别用乙醇、乙醚洗涤。后将得到的白色粉末溶解在去离子水中并透析(预润湿的MWCO 1000RC管)：首先用100mM NaCl溶液透析2天，然后用蒸馏水和乙醇(5:1)的混合物透析1天，再用去离子水透析1天。冻干后即可得到透明质酸
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透明质酸结合物。
[0011](3)采用反相微乳液法制备透明质酸微凝胶
[0012]将2mL HA
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TA溶液与1.5U/mL辣根过氧化物酶在PBS中混合，得到一定比例的HRP与HA的混合溶液。将该溶液滴加到25mL异辛烷中(含有2.5％v/v的司盘80和0.25％v/v的吐温80)，后在0℃下用超速搅拌器以预定速度均化。向微乳液中加入20μL的H2O2溶液，均化10min，将混合物磁力搅拌30min，在冰冷的丙酮中沉淀收集颗粒。然后以8000rpm离心5min，用丙酮和乙醇洗涤颗粒，并在室温下减压干燥。
[0013](4)TGF
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β1生长因子的负载
[0014]在5mg的HA
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TA微凝胶中，加入1mL的TGF
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β1溶液(含有0.1％(w/v)BSA)，将得到的悬浮液孵育过夜。离心微凝胶，并使用试剂盒测量上清液中残留的TGF
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β1的量。可通过收集上清液并定量未负载的生长因子的量来评估蛋白质负载量。分别在4℃和37℃的吸收温度下测定TGF
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β1在微凝胶中的释放曲线。
具体实施方式：
[0015]具体实施方式一：
[0016]将透明质酸
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透明质酸结合物到25mL含有作为表面活性剂的2.5％v/v的司盘80和0.25％v/v的吐温80异辛烷与HRP的混合溶液中制备HA
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TA微凝胶，加入20μL的H2O2溶液，在H2O2与TA的摩尔比分别为1:1、1:2、2:1的条件下，考察H2O2与TA摩尔比对凝胶产率的影响。
[0017]具体实施方式二：
[0018]本实施方式与具体实施方式一的不同点在于反应温度分别为3、25、37℃，考察反应温度对HRP的活力的影响。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备可有效递送TGF
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β1生长因子的透明质酸微凝胶的方法，其特征通过以下步骤实现：步骤一：透明质酸钠的活化，将1g分子量为25kDa(含2.5mmol COOH基团)的透明质酸钠溶解在30mL的PBS中；加入1.0g EDAC和1.3g NHS，并将溶液搅拌2h；将产物在冷乙醇中沉淀、过滤，先后用乙醇、乙醚进行洗涤；步骤二：透明质酸酪胺(HA
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TA)的合成，将1.0g具有NHS活化的COOH基团的聚合物溶解在30mLpH 6.1MES缓冲液中；后将385mg酪胺溶解在4mL二甲基甲酰胺中，并加入溶液中；搅拌过夜，将所得溶液在冷乙醇中沉淀、过滤，并分别用乙醇、乙醚洗涤；后将得到的白色粉末溶解在去离子水中并透析(预润湿的MWCO 1000RC管)：首先用100mM NaCl溶液透析2天，然后用蒸馏水和乙醇(5:1)的混合物透析1天，再用去离子水透析1天，冻干后即可得到透明质酸
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透明质酸结合物；步骤三：采用反相微乳液法制备透明质酸微凝胶，将2mL HA
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TA溶液与1.5U/mL辣根过氧化物酶在PBS中混合，得到一定比例的HRP与HA的混合溶液；将该溶液滴加到25mL异辛烷中(含有2.5％v/v的司盘80和0.25％v/v的吐温80)，后在0℃下用超速搅拌器以预定速度均化；向微乳液中加入20μL的H2O2溶液，均化10min，将混合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：于殿宇，陈星，李子越，胡晓欢，吉晓蕊，杨福明，谢凤英，王立琦，江连洲，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：