一种脂肪酶CALBgold及其制备方法、应用技术

本发明专利技术公开一种脂肪酶CALBgold及其制备方法、应用，所述脂肪酶CALBgold的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术提供的脂肪酶CALBgold是在原南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶CALB(GenBank：Z30645.1)的基础上，通过人工的理性设计对脂肪酶CALB进行了定点突变改造，通过对脂肪酶CALB上的第105位、第110位、第154位、第173位、第188位及第260位等六个位点上的氨基酸进行了突变，大幅度增加了脂肪酶CALBgold的酯化和转酯活力及稳定性，通过人工定向改造，显著提高了脂肪酶CALBgold的表达水平和活性，与原始脂肪酶CALB相比，脂肪酶CALBgold的活性提高了约20倍，使得脂肪酶CALBgold具有高产、高酯化活性和高转酯活性的优点，适于工业化生产。适于工业化生产。适于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪酶CALBgold及其制备方法、应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种脂肪酶CALBgold及其制备方法、应用。

技术介绍

[0002]脂肪酶即甘油酯水解酶，是一类水解油酯的酶类。脂肪酶的水解底物一般是天然油脂，其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键。另一方面，在非水相体系中，脂肪酶具有酯化、转酯等活力，是合成酯和脂肪酸酯(生物柴油)的优良、绿色的催化剂。在众多脂肪酶中，来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B(CALB)是用途最为广泛的酶之一。CALB是一种优良的脂肪酶，在水相、有机相中均具有很强的催化活性。CALB具有特殊的活性中心结构，有较为优良的酯化和转酯能力，具有广谱的底物接受性。因此与其他脂肪酶相比，CALB的用途最为广泛。比如在酯化、转酯、水解、手性化合物拆分、有机物合成等方面都具有较高的反应速率和立体选择性，拥有较好的催化性能。
[0003]但目前，CALB在pH稳定性和热稳定性等方面能力相对较弱。当脂肪酶CALB处在低pH值环境中时，如当反应体系中游离脂肪酸含量高时，CALB的活性衰失较快。在酯化和转酯的正常体系条件下，在温度大约在50
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60℃之间时CALB的失活较快，且它的失活速度随温度升高会加快。因此，实现高产、高酯化活性和高转酯活性的表达是实现脂肪酶CALB的工业化应用的前提。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的是提出一种脂肪酶CALBgold及其制备方法、应用，旨在提供一种高产、高酯化活性和高转酯活性的脂肪酶。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提出一种脂肪酶CALBgold，所述脂肪酶CALBgold的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0006]本专利技术还提出一种脂肪酶基因calbgold，用于编码如上所述的脂肪酶CALBgold，所述脂肪酶基因calbgold的核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有95％以上的同一性。
[0007]本专利技术还提出一种重组表达载体，包括如上所述的脂肪酶基因calbgold。
[0008]本专利技术还提出一种如上所述的重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：
[0009]将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶EcoR I和Xba I，得到双酶切的脂肪酶基因片段；
[0010]将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体。
[0011]本专利技术还提出一种重组表达菌株，包括如上所述的脂肪酶基因calbgold。
[0012]可选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。
[0013]本专利技术还提出一种如上所述的重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：
[0014]将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶EcoR I和Xba I，得到双酶
切的脂肪酶基因片段；
[0015]将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体；
[0016]将所述重组表达载体线性化后导入宿主细胞中，获得重组表达菌株。
[0017]本专利技术还提出一种如上所述的脂肪酶CALBgold的制备方法，包括以下步骤：
[0018]将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶EcoR I和Xba I，得到双酶切的脂肪酶基因片段；
[0019]将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体；
[0020]将所述重组表达载体线性化后导入宿主细胞中，获得重组表达菌株；
[0021]培养所述重组表达菌株，从培养物中获得脂肪酶CALBgold。
[0022]本专利技术还提出一种合成酯的制备方法，在酯化反应中加入如上所述的脂肪酶CALBgold。
[0023]本专利技术还提出一种脂肪酸酯的制备方法，在转酯反应中加入如上所述的脂肪酶CALBgold。
[0024]本专利技术提供的脂肪酶CALBgold是在原南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶CALB(GenBank：Z30645.1)的基础上，通过人工的理性设计对脂肪酶CALB进行了定点突变改造，通过对脂肪酶CALB上的第105位、第110位、第154位、第173位、第188位及第260位等六个位点上的氨基酸进行了突变，大幅度增加了脂肪酶CALBgold的酯化和转酯活力及稳定性，通过人工定向改造，显著提高了脂肪酶CALBgold的表达水平和活性，与原始脂肪酶CALB相比，脂肪酶CALBgold的活性提高了约20倍，使得脂肪酶CALBgold具有高产、高酯化活性和高转酯活性的优点，适于工业化生产。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0026]图1为本专利技术实施例1中原始脂肪酶CALB的三维结构图；
[0027]图2为本专利技术实施例1中改造后的脂肪酶CALBgold的三维结构图；
[0028]图3为本专利技术实施例1中原始脂肪酶基因calb的密码子使用频率图；
[0029]图4为本专利技术实施例1中获得的脂肪酶基因calbgold的密码子使用频率图；
[0030]图5为本专利技术实施例2中构建的重组表达载体pPICZαA
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calbgold和pPICZαA
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calb的单酶切检验结果图；
[0031]图6为本专利技术实施例2中构建的重组表达载体pPICZαA
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calbgold和pPICZαA
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calb的双酶切检验结果图；
[0032]图7为本专利技术实施例3中构建的重组表达菌株的发酵上清液的SDS
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PAGE测试结果图；
[0033]图8为本专利技术实施例3中构建的重组表达菌株的发酵上清液的酶活测试结果图；
[0034]图9为本专利技术实施例4中改造后的脂肪酶CALBgold和原始脂肪酶CALB的酯化率随时间变化图；
[0035]图10为本专利技术实施5中改造后的脂肪酶CALBgold和原始脂肪酶CALB的转酯化率随时间变化图。
[0036]本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
[0037]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0038]需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶CALBgold，其特征在于，所述脂肪酶CALBgold的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种脂肪酶基因calbgold，用于编码如权利要求1所述的脂肪酶CALBgold，其特征在于，所述脂肪酶基因calbgold的核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有95％以上的同一性。3.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求2所述的脂肪酶基因calbgold。4.一种如权利要求3所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将脂肪酶基因calbgold的两端分别引入限制性内切酶EcoR I和Xba I，得到双酶切的脂肪酶基因片段；将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体。5.一种重组表达菌株，其特征在于，包括如权利要求2所述的脂肪酶基因calbgold。6.如权利要求5所述的重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。7.一种如权利要求5或6所述的重组表达菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨江科，刘桂子，雷磊，卢传琦，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：