可可细胞悬浮方案制造技术

本发明专利技术提供了利用幼叶作为外植体来源建立可可属(Theobroma)细胞悬浮培养物的方法。还提供了用于产生可可属细胞悬浮培养物的诱导、增殖和悬浮培养基。这些方法和培养基可用于在可可属中产生次生代谢物，以及用于分离与可可属疾病相关的病毒粒子。可可属疾病相关的病毒粒子。可可属疾病相关的病毒粒子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】可可细胞悬浮方案


[0001]本公开一般性涉及植物细胞培养物，更具体地涉及建立可可属(Theobroma)细胞悬浮培养物的方法。

技术介绍

[0002]可可属是锦葵科(Malvaceae)的一个开花植物属。可可属包含大约20种小型林下乔木，原产于中美洲和南美洲的热带森林。可可树(Theobroma cacao)可用于制作巧克力。
[0003]植物细胞悬浮培养是一种植物细胞在培养基中自由漂浮生长的方法。可可属细胞悬浮培养物通常适于大规模生产可可属次生代谢物，如可可碱。以往建立可可属细胞悬浮培养物的尝试主要依靠使用子叶或发育中的种子作为外植体材料。参见，例如，Tsai和Kinsella，Annals of Botany 48.4(1981)：549
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558；Leathers and Scragg，Plant science 62.2(1989)：217
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227；Rojas等人，Actualidades Biol
ó
gicas 30.89(2008)：117
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123；Parra等人，Plant physiology and biochemistry 111(2017)：59
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66；R
ú
a等人，Bioprocess and biosystems engineering40.10(2017)：1479
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1492；Gallego等人，Scientific reports 8.1(2018)：13575。然而，在商业生产规模上获得这些种类的外植体可能是耗时且费力的，并且可全面增加可可属相关产品的商业生产成本。
[0004]因此，需要改进的方法，为建立可可属细胞悬浮培养物提供有效率且有效的方案。

技术实现思路

[0005]本文提供了利用幼叶作为外植体来源建立可可属细胞悬浮培养物的方法，所述方法适合于生产可可属次生代谢物以及分离与可可属疾病有关的病毒。本文还提供了用于所述方法的生长培养基。
[0006]在一个方面，本文提供了一种如下所述的制备可可属细胞悬浮培养物的方法：从可可属叶片获得外植体；对所述外植体进行灭菌；在愈伤组织诱导培养基上从所述外植体诱导松脆型愈伤组织；将诱导的愈伤组织在愈伤组织增殖培养基上增殖；以及将增殖的愈伤组织悬浮在悬浮培养基中。在一些实施方式中，愈伤组织诱导培养基包含基础植物培养基、1
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萘乙酸(NAA)和6
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苄基氨基嘌呤(BAP)。在某些变体中，1
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萘乙酸(NAA)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在；6
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苄基氨基嘌呤(BAP)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在。
[0007]在一些实施方式中，所述灭菌包括将所述外植体在真空下在次氯酸盐溶液中接触。在一些实施方式中，所述愈伤组织增殖培养基包含基础植物培养基和谷氨酰胺。在一些实施方式中，所述悬浮培养基包含基础植物培养基和L
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甘氨酸。在一些实施方式中，所述松脆型愈伤组织的诱导是在16小时光照和8小时黑暗的光周期后得到的。在一些实施方式中，提供了由上述方法产生的可可属细胞悬浮培养物。
[0008]在另一个方面，本文提供了一种如下所述的产生可可属次生代谢物的方法：从可可属叶片获得外植体；对所述外植体进行灭菌；在愈伤组织诱导培养基上从所述外植体诱导松脆型愈伤组织；将转化的松脆型愈伤组织在愈伤组织增殖培养基上增殖；将增殖的愈
伤组织悬浮在悬浮培养基中；以及从悬浮培养基中回收次生代谢物。在一些实施方式中，所述愈伤组织诱导培养基包含基础植物培养基、1
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萘乙酸(NAA)和6
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苄基氨基嘌呤(BAP)。在某些变体中，1
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萘乙酸(NAA)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在；6
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苄基氨基嘌呤(BAP)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在。
[0009]在一些变体中，所述产生可可属次生代谢物的方法还包括用可表达的转基因转化所述诱导的愈伤组织，所述转基因编码所述次生代谢物生物合成途径中的产物。在一些实施方式中，所述转化是通过粒子轰击或通过土壤杆菌(Agrobacterium)介导来实现的。在一些实施方式中，所述次生代谢物是苯酚、类黄酮、甲基黄嘌呤或脂肪酸。在一些实施方式中，所述可可属是可可树、大花可可(Theobroma grandiflorum)或二色可可(Theobroma bicolor)。在一些实施方式中，所述灭菌包括将所述外植体在真空下在次氯酸盐溶液中接触。在一些实施方式中，所述愈伤组织增殖培养基包含基础植物培养基和谷氨酰胺。在一些实施方式中，所述悬浮培养基包含基础植物培养基和L
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甘氨酸。在一些实施方式中，所述松脆型愈伤组织的诱导是在16小时光照和8小时黑暗的光周期后得到的。
[0010]在一些可与任何上述实施方式和变体组合的实施方式中，所述方法还包括将所述细胞悬液与一种或多种病毒一起共培养。在一些实施方式中，所述一种或多种病毒包括可可肿枝病毒(CSSV)。在一些实施方式中，提供了通过上述方法产生的可可属次生代谢物。
[0011]在又一个方面，本文提供了一种用于从可可属叶片外植体诱导松脆型愈伤组织的愈伤组织诱导培养基，其包含：基础植物培养基、1
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萘乙酸(NAA)和6
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苄基氨基嘌呤(BAP)。在某些变体中，1
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萘乙酸(NAA)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在；6
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苄基氨基嘌呤(BAP)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在。在其它变体中，所述愈伤组织诱导培养基还包含维生素混合物。
[0012]在又一个方面，本文提供了一种用于增殖从可可属叶片外植体诱导的松脆型愈伤组织的愈伤组织增殖培养基，其包含：基础植物培养基和浓度为1mg/L至5mg/L的噻苯隆(tidiazuron)(TDZ)。在一些变体中，所述愈伤组织诱导培养基还包含维生素混合物。
附图说明
[0013]图1显示了用于获得外植体的代表性叶片的照片。
[0014]图2显示了在1型、2型和3型叶片中的消毒效果(对于叶片类型表征，参见Greathouse等人，American journal of botany 58.4(1971)：281
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286)。
[0015]图3显示了次氯酸钙和酒精在消灭叶片外植体上的真菌中的消毒效果。
[0016]图4显示了次氯酸钙和酒精在消灭叶片外植体上的细菌中的消毒效果。
[0017]图5显示了BAP/AIA激素平衡和光周期条件对愈伤组织形成的效果。
[0018]图6显示了BAP/AIA激素平衡对愈伤组织形成的效果。
[0019]图7显示了BAP/NAA激素平衡对愈伤组织形成的效果。
[0020]关于图5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备可可属(Theobroma)细胞悬浮培养物的方法，所述方法包括：从可可属叶片获得外植体；对所述外植体进行灭菌；在愈伤组织诱导培养基上从所述外植体诱导松脆型愈伤组织，其中所述愈伤组织诱导培养基包含基础植物培养基、浓度为0.5mg/L至5mg/L的1
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萘乙酸(NAA)和浓度为0.5mg/L至5mg/L的6
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苄基氨基嘌呤(BAP)；将诱导的愈伤组织在愈伤组织增殖培养基上增殖；以及将增殖的愈伤组织悬浮在悬浮培养基中。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述可可属是可可树(Theobroma cacao)、大花可可(Theobroma grandiflorum)或二色可可(Theobroma bicolor)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述灭菌包括将所述外植体在真空条件下在次氯酸盐溶液中接触。4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中所述愈伤组织诱导培养基还包含维生素混合物。5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中所述愈伤组织增殖培养基包含基础植物培养基和谷氨酰胺。6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中所述悬浮培养基包含基础植物培养基和L
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甘氨酸。7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中所述松脆型愈伤组织的诱导是在16小时光照和8小时黑暗的光周期后得到的。8.一种通过根据权利要求1
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7中的任一项所述的方法产生的可可属细胞悬浮培养物。9.一种产生可可属次生代谢物的方法，所述方法包括：从可可属叶片获得外植体；对所述外植体进行灭菌；在愈伤组织诱导培养基上从所述外植体诱导松脆型愈伤组织，其中所述愈伤组织诱导培养基包含基础植物培养基、浓度为0.5mg/L至5mg/L的1
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萘乙酸(NAA)和浓度为0.5mg/L至5mg/L的6
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苄基氨基嘌呤(BAP)；将转化的松脆型愈伤组织在愈伤组织增殖培养基上增殖；将增殖的愈伤组织悬浮在悬浮培养基中；以及从所述悬浮培养基中回收次生代谢物。10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括用可表达的转基因转化诱导的愈伤组织，所述转基因编码所述次生代谢物生物合成途径中的产物。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述转化是通过粒子轰击或通过土壤杆菌(Agrobacterium)介导来实现的。12.根据权利要求9至11中的任一项所述的方法，其中所述次生代谢物是苯酚、类黄...

【专利技术属性】
技术研发人员：克劳迪娅，
申请(专利权)人：马斯公司，
类型：发明
国别省市：