对变异链球菌具有抗菌活性的联合抗菌肽及其应用制造技术

本发明专利技术提供了对变异链球菌具有抗菌活性的联合抗菌肽及其应用，所述联合抗菌肽为GHaR抗菌肽和GHa11R抗菌肽。该联合抗菌肽具有更强、更快的抗变异链球菌活性，更好的抗生物被膜活性，较低的细胞毒性，使其成为预防龋齿的新型候选药物。新型候选药物。新型候选药物。

【技术实现步骤摘要】
对变异链球菌具有抗菌活性的联合抗菌肽及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及对变异链球菌具有抗菌活性的联合抗菌肽及其应用。

技术介绍

[0002]龋齿是常见的口腔疾病，据第四次中国口腔健康流行病学调查，中国5岁儿童和35
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64岁的中老年患龋率高达71.9％和89％以上，严重影响了国民的口腔健康。人类口腔内微生物种类和数量繁多，有多种细菌和真菌，但变异链球菌(Streptococcus mutans)是人类最主要的致龋菌。它们能在牙齿表面黏附，并促进其他口腔微生物的聚集，形成以细菌为主体的微生态环境，即牙菌斑生物被膜(biofilm)。牙菌斑生物被膜是自然界中最复杂的生物被膜系统之一，被生物被膜包裹的微生物代谢活性低、对药物耐受性强，是细菌产生耐药性的重要因素之一。被膜内的变异链球菌利用碳水化合物产酸，导致牙釉质脱矿，硬组织崩解，龋洞形成而致龋，目前尚无有效的治疗方法。通过临床观察和流行病学调查发现，慢性口腔感染性疾病也是发生心血管疾病的风险因素之一。在患心血管疾病的病人心脏瓣膜及粥样斑块中匀检测出来自口腔的变异链球菌，而其他菌种如牙周可疑致病菌的检出率则较低。因此龋齿已成为全球严重的公共卫生问题之一。
[0003]目前，致龋生物被膜主要通过非特异性的机械方法去除(如刷牙)，但清除效率不高；或使用含有化学成分的漱口水，牙膏等。醋酸氯己定是临床常用消毒剂，也是治疗口腔感染的常用药物，在口腔日常护理产品中也广泛使用。但长期使用会造成牙齿变色、过敏、组织损伤等；而且对醋酸氯己定等消毒剂耐药的细菌，对常见抗生素也显示出交叉耐药性，使临床耐药菌感染性疾病的治疗雪上加霜。含氟牙膏长期使用，易导致氟斑牙，还能引起内分泌功能异常等。

技术实现思路

[0004]针对以上不足，本专利技术提供了对变异链球菌具有抗菌活性的联合抗菌肽及其应用，具有更强、更快的抗变异链球菌活性，更好的抗生物被膜活性，较低的细胞毒性，使其成为预防龋齿的新型候选药物。
[0005]为了实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0006]本专利技术提供了对变异链球菌具有抗菌活性的联合抗菌肽，所述联合抗菌肽为GHaR抗菌肽和GHa11R抗菌肽。
[0007]优选地，GHaR抗菌肽的氨基酸序列为：
[0008]H
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Phe
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Leu
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Gln
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Arg
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Ile
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Ile
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Gly
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Ala
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Leu
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Gly
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Arg
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Leu
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Phe
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NH2。
[0009]优选地，GHa11R抗菌肽的氨基酸序列为：
[0010]H
‑
Phe
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Leu
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Gln
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His
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Ile
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Ile
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Gly
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Ala
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Leu
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Gly
‑
Arg
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Leu
‑
Phe
‑
NH2。
[0011]优选地，所述联合抗菌肽同时具有抗生物被膜生成及抑制成熟生物被膜的活性。
[0012]优选地，所述变异链球菌包括但不限于变异链球菌ATCC 25175。
[0013]更优选地，所述联合抗菌肽对变异链球菌的最低抑菌浓度(MIC)值为0.8μM，分级抑制浓度指数(FICI)为0.5。
[0014]本专利技术还提供了上述联合抗菌肽的应用，所述应用包括在制备预防龋齿的产品中的应用。
[0015]优选地，所述产品包括药物。
[0016]本专利技术另提供了一种药物组合物，包括上述联合抗菌肽。
[0017]本专利技术的有益效果在于：
[0018]本专利技术通过将两种抗菌肽联合使用，使其具有更好的抗变异链球菌活性与杀菌效率；可以联合作用于细菌细胞膜和细胞内靶点，使细菌死亡；能够更好地抑制生物被膜的形成，并破坏成熟的生物被膜。GHaR和GHa11R联合使用有望成为预防龋齿的候选分子，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0019]图1显示抗菌肽对变异链球菌膜电位的影响。
[0020]图2显示透射电镜观察抗菌肽对变异链球菌形态的影响，A为磷酸缓冲液(PBS)处理的变异链球菌，B为12.5μM GHaR处理的变异链球菌，C为12.5μM GHa11R处理的变异链球菌。
[0021]图3显示抗菌肽对变异链球菌生物被膜的抑制作用(A
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C)及对成熟生物被膜的破坏作用(D
‑
F)。
[0022]图4显示GHaR及GHa11R对口腔上皮细胞毒性。
具体实施方式
[0023]为了更清楚地说明本专利技术，下面结合实施例并对照附图对本专利技术作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。
[0024]本专利技术中使用的变异链球菌(ATCC 25175)来自于广东微生物菌种保藏中心。
[0025]我们从海南沼蛙(Hylarana guentheri)皮肤中发现temporin抗菌肽。含有13个氨基酸残基，是已知最短的天然抗菌肽之一，因其结构简单，也是理想的抗菌肽分子优化设计的模板。我们对temporin
‑
GHa分子进行了结构改造。改造后的temporin衍生肽GHa11R和GHaR对变异链球菌的活性比母肽显著增强，与阳性对照药醋酸氯已定(MIC＝3.1μM)活性相当。GHa11R与母肽GHa，及与GHaR仅有单个氨基酸差异，但其活性及在细菌的作用靶点上却显示出明显不同。GHaR与多数已发现的抗菌肽作用方式类似，能破坏细菌细胞膜，使内溶物泄露；而GHa11R对细菌形态结构无明显影响，因此推测其作用于细菌的细胞内靶点发挥抗菌作用。GHa11R和GHaR联合使用表现出更强的抑制变异链球菌生物被膜生成，及破坏成熟的生物被膜的作用。
[0026]实施例
[0027]1.抗菌肽的合成
[0028]利用N
‑9‑
芴基甲氧羰基(Fmoc)固相合成法，制备液相色谱仪(LC6000)用于制备，高效液相色谱仪(LC3000)用于分析。制备液相条件：制备柱为C18柱，流动相A为含0.1％TFA
的超纯水，流动相B为100％乙腈(含0.1％TFA)，流速180mL
·
min
‑1，220nm检测。肽的C
‑
末端进行酰胺化修饰，反相高效液相色谱纯化，纯度≥95％，通过电喷射质谱鉴定抗菌肽。
[0029]2.抗菌肽联合用药
[0030]通过棋盘法测定GHaR，GHa11R以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.对变异链球菌具有抗菌活性的联合抗菌肽，所述联合抗菌肽为GHaR抗菌肽和GHa11R抗菌肽。2.根据权利要求1所述的对变异链球菌具有抗菌活性的联合抗菌肽，其特征在于，所述GHaR抗菌肽的氨基酸序列为：H
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Phe
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Leu
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Gln
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Arg
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Ile
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Ile
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Gly
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Ala
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Leu
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Gly
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Arg
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Leu
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Phe
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NH2。3.根据权利要求1所述的对变异链球菌具有抗菌活性的联合抗菌肽，其特征在于，所述GHa11R抗菌肽的氨基酸序列为：H
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Phe
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Leu
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Gln
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His
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Ile
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Ile
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【专利技术属性】
技术研发人员：张英霞，满初日嘎，魏涵淇，谢志鹏，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：