一种固定化双酶-无机杂化纳米花及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及酶固定化技术领域，尤其涉及一种固定化双酶

【技术实现步骤摘要】
一种固定化双酶
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无机杂化纳米花及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及酶固定化
，尤其涉及一种固定化双酶
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无机杂化纳米花及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]D
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(
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)
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对羟基苯甘氨酸，化学名为D
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α
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氨基对羟基苯乙酸，分子式为(OH)C6H4NH2CHCOOH，分子量为167.2，化学结构式如式Ⅰ所示。
[0003][0004]D
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(
‑
)
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对羟基苯甘氨酸是β
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内酰胺类半合成抗生素阿莫西林、阿扑西林、头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢罗奇和头孢哌酮等的侧链，是国家重点发展的一种药物中间体。国内的D
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(
‑
)
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对羟基苯甘氨酸长期依赖进口，仅河北省制药行业每年为此花费上千万美元的外汇，因此有必要对该中间体的生产进行系统研究，研发一种经济高效的新生产方法。
[0005]生物酶催化具有作用条件温和、绿色无污染、独特和高效的底物选择性等优点，被广泛应用在医药、食品、化工以及环境保护方面。但是游离酶在使用过程中常常表现出稳定性差、难以重复使用、使用成本高等问题。酶的固定化技术是提高酶稳定性、改善酶催化性能的主要方法。固定化的酶不仅易于与底物、产物分离，而且可以长时间内重复使用，降低成本。并能够在绝大多数情况下提高酶的稳定性，且能够用于多酶级联反应。但是，传统的酶固定化制备过程繁琐，载体的存在导致酶和底物的传质阻力增大，以及共价键的形成使酶分子构象发生改变，从而导致酶活损失较大所制备的固定化酶酶活较低。因此，开发新的催化活力高、稳定性好的酶固定化方法成为提高酶催化性能亟待解决的问题。
[0006]酶
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无机杂化纳米花是近年来发展起来的一种新型固定化酶方法，它具有合成步骤简单、条件温和的特点。而且与游离酶相比，所制备的杂化纳米花固定化酶表现出更好的催化性能。因此，酶
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无机杂化纳米花是一种极大潜力的固定化酶方法。纳米花在化学中是指某元素的化合物，从微观观点形成了花，称为纳米花。这些形成物的长度和厚度都在纳米范围，因此只能用电子显微镜观察。固定化双酶
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无机杂化纳米花技术，不仅大大降低了传统固定化载体的成本，同时实现了一酶双用，而且提高了固定化收率，固定化纳米花的酶活远远高于固定化载体的酶活，稳定性也远远高于固定化载体。
[0007]因此，如何克服传统固定化树脂载体的活性不高，稳定性差和重复使用性差的缺点，提供一种操作简单、成本低、重复性好，所得固定化酶活力高的固定化双酶
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无机杂化纳米花的制备方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种固定化双酶
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无机杂化纳米花及其制备方法与应用，解决了传统固定化酶技术操作复杂，成本高，所得固定化酶活力低的技术问题。本专利技术制备得到的固定化双酶
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无机杂化纳米花的稳定性优于传统以树脂为载体的固定化酶，而且酶活高于传统固定化酶活。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]本专利技术提供了一种固定化双酶
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无机杂化纳米花的制备方法，包括以下步骤：
[0011](1)将酶液与磷酸氢二钾混合(混合后的溶液pH为8.0)，然后调节pH至6.0～6.1，得到酶的磷酸盐溶液；
[0012](2)将步骤(1)得到的酶的磷酸盐溶液静置，离心得沉淀，并将沉淀洗涤。
[0013]优选的，步骤(1)所述磷酸氢二钾与酶液的质量体积比为1～3g∶80～120ml。
[0014]优选的，步骤(1)所述酶液中含有D
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对羟基苯海因酶和N
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氨甲酰水解酶。
[0015]优选的，步骤(1)所述调节pH所用试剂为质量浓度为20～30％的氯化锰溶液。
[0016]优选的，所述D
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对羟基苯海因酶和N
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氨甲酰水解酶的酶活独立为4～8MU/ml。
[0017]优选的，步骤(2)所述静置时间为10～14h。
[0018]优选的，步骤(2)所述离心转速为4000～5000转/分钟，时间为4～6min。
[0019]优选的，步骤(2)所述洗涤所用试剂为质量浓度为0.05～0.15％的氯化锰溶液。
[0020]优选的，步骤(2)所述沉淀与氯化锰溶液的质量体积比为2～4g∶8～16ml。
[0021]本专利技术还提供了所述的一种固定化双酶
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无机杂化纳米花的制备方法制备得到的固定化双酶
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无机杂化纳米花。
[0022]本专利技术还进一步的提供了所述的固定化双酶
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无机杂化纳米花在制备D
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(
‑
)
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对羟基苯甘氨酸中的应用。
[0023]本专利技术对所述D
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对羟基苯海因酶和N
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氨甲酰水解酶的来源没有特殊限定，在本专利技术具体实施过程中，优选的通过细菌发酵制得，具体为：
[0024](1)将大肠杆菌BL21(DE3)发酵后离心(4500转/min，15
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30min)，收集菌体，将菌体用0.02～0.03M的磷酸盐缓冲液稀释定容，将菌浓稀释到17％
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18％(菌浓是指单位体积培养液中菌体的含量，是百分含量，例如离心10毫升发酵液，菌体所占体积为1.7
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1.8毫升，计算公式为1.7/10*100＝17％)；
[0025](2)将步骤(1)稀释好的菌液进行细胞破碎，将蛋白释放到清液中，破碎率达到93～97％以上，破碎完后加入发酵液体积的0.5～0.7％的絮凝剂
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聚丙烯酰胺，离心收集上清液，将上清液进超滤浓缩，得到超滤浓缩液。超滤浓缩液即为D
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对羟基苯海因酶蛋白液或N
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氨甲酰水解酶蛋白液。
[0026]优选的，在超滤浓缩过程中，超滤膜截留分子量为10000，进膜压力0.3兆帕。
[0027]优选的，步骤(2)所述离心转速为4000～5000转/分钟，时间为4～6min。
[0028]与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
[0029]1、生物酶因其优异的催化活性和反应特异性被广泛应用于医药领域，但酶稳定性差，不可回收而造成的高昂研究成本限制了其发展。为提高其催化活性和稳定性，各种酶固定化技术不断涌现。近年来，为了克服传统的固定化酶法，一种新型、简单的酶
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无机杂化纳米花材料被提出。它通过金属化合物与磷酸缓冲溶液还有酶自组装形成各种各样的杂化纳
米结构，因为体系本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化双酶
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无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将酶液与磷酸氢二钾混合，然后调节pH至6.0～6.1，得到酶的磷酸盐溶液；(2)将步骤(1)得到的酶的磷酸盐溶液静置，离心得沉淀，并将沉淀洗涤。2.根据权利要求1所述的一种固定化双酶
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无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述磷酸氢二钾与酶液的质量体积比为1～3g∶80～120ml。3.根据权利要求1所述的一种固定化双酶
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无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述酶液中含有D
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对羟基苯海因酶和N
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氨甲酰水解酶；步骤(1)所述调节pH所用试剂为质量浓度为20～30％的氯化锰溶液。4.根据权利要求3所述的一种固定化双酶
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无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，所述D
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对羟基苯海因酶和N
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氨甲酰水解酶的酶活独立为4～8MU/ml。5.根据权利要求1所述的一种固定化双酶
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【专利技术属性】
技术研发人员：彭友兵，
申请(专利权)人：河北凯恩利生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：