表达非洲猪瘟病毒B602L-B646L蛋白的重组腺病毒及构建方法技术

本发明专利技术公开了一种表达非洲猪瘟病毒B602L

【技术实现步骤摘要】
表达非洲猪瘟病毒B602L
‑
B646L蛋白的重组腺病毒及构建方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种表达非洲猪瘟病毒B602L
‑
B646L蛋白的重组腺病毒及构建方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病。临床表现为发热、皮肤发绀、淋巴结、肾、胃肠黏膜明显出血等。
[0003]非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是目前唯一的DNA虫媒病毒，通常认为只有一个血清型，国际上根据ASFV B646L基因末端一段478bp的核酸序列，将ASFV分为24个基因型，我国多属于基因Ⅱ型。非洲猪瘟病毒可通过家猪、野猪和软蜱进行传播，主要攻击猪单核、巨噬细胞。病毒粒子直径为175
‑
215纳米，呈20面体对称，有囊膜，结构由内到外分别是类壳、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170
‑
193kb，有150
‑
167个开放阅读框，编码50多种结构蛋白和100多种非结构蛋白。参与病毒粒子结构构成的物质主要包括结构蛋白、基因转录和RNA修饰酶类。作为病毒粒子的主要成分，结构蛋白在ASFV吸附、侵入和复制等感染过程中起着重要作用。编码的蛋白主要有p72、p49、p30、p54、B602L等。B602L作为分子伴侣参与p72核衣壳蛋白的折叠，位于病毒工厂之外，不是病毒颗粒的一部分，是一个晚期非结构蛋白，但是ASFV的强免疫原性抗原。缺失B602L蛋白会产生异常的拉链状结构，无法形成二十面体病毒颗粒。p72是ASFV主要的结构蛋白，由B646L基因编码，分子量约为73kDa，在病毒感染晚期表达，是病毒二十面体衣壳的重要组成成分，存在于病毒衣壳的表面，具有良好的免疫原性和抗原性。p72参与病毒的吸附，针对p72的抗体可以阻断病毒与巨噬细胞的结合，但是在抗体介导的免疫保护中不起决定性作用。p72还参与了病毒装配过程中p220和p62的加工。p72编码基因的同源性较高，因此常用于ASFV基因的分型，并作为靶蛋白用于ASFV抗原的研究。目前还没有针对B602L
‑
B646L的重组腺病毒以及制备该重组腺病毒的可行方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种表达非洲猪瘟病毒B602L
‑
B646L蛋白的重组腺病毒及构建方法，以解决上述现有技术存在的问题，为研究非洲猪瘟候选疫苗奠定技术基础。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种表达非洲猪瘟病毒B602L
‑
B646L蛋白的重组腺病毒载体，以pAD
‑
CMV
‑3×
FLAG腺病毒载体为基础，引入B602L
‑
B646L基因以构建重组腺病毒载体pAD
‑
CMV
‑
EGFP
‑
B602L
‑
B646L；所述B602L
‑
B646L基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
[0007]本专利技术还提供一种上述的表达非洲猪瘟病毒B602L
‑
B646L蛋白的重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
[0008](1)合成B602L
‑
B646L基因，并在B602L
‑
B646L基因的起始密码子前添加CACC四个碱基；
[0009](2)将步骤(1)得到的B602L
‑
B646L基因和pENTRE
‑
EGFP
‑
TOPO载体进行TOPO克隆，得到pENTR
‑
EGFP
‑
ASFV
‑
B602L
‑
B646L；
[0010](3)将步骤(2)得到的pENTR
‑
EGFP
‑
ASFV
‑
B602L
‑
B646L通过LR重组反应于腺病毒骨架载体pAD
‑
CMV
‑3×
FLAG进行重组，得到重组腺病毒载体pAD
‑
CMV
‑
EGFP
‑
B602L
‑
B646L。
[0011]本专利技术还提供一种重组腺病毒包装方法，将上述的重组腺病毒载体pAD
‑
CMV
‑
EGFP
‑
B602L
‑
B646L用PacⅠ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染；转染293t细胞，实现重组腺病毒包装。
[0012]进一步地，包括以下步骤：
[0013](1)将重组腺病毒载体pAD
‑
CMV
‑
EGFP
‑
B602L
‑
B646L用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，线性化后的质粒用于转染AD293细胞；
[0014](2)转染后至细胞脱落、变圆且间隙变大时，收集细胞及上清，即为P1代重组腺病毒；
[0015](3)P1代重组腺病毒感染293t细胞，观察细胞状态。
[0016]进一步地，所述转染AD293细胞采用的转染试剂为ietPRIME kit转染试剂。
[0017]进一步地，在步骤(2)中，收集细胞及上清后，置于
‑
80℃反复冻融3次，12000
×
g离心10min，收集上清。
[0018]本专利技术还提供上述的重组腺病毒包装方法制备得到的重组腺病毒，以及包含上述的重组腺病毒的疫苗。
[0019]本专利技术公开了以下技术效果：
[0020]本专利技术利用重组腺病毒穿梭载体pENTRE
‑
EGFP
‑
TOPO，经过一系列中间过程，得到重组腺病毒载体pAD
‑
CMV
‑
EGFP
‑
B602L
‑
B646L；将其线性化后转染AD293细胞，根据腺病毒感染形成的细胞病变筛选重组病毒，实现腺病毒包装过程，获得表达非洲猪瘟病毒B602L
‑
B646L蛋白的重组腺病毒，为构建表达非洲猪瘟病毒B602L
‑
B646L蛋白的重组腺病毒疫苗奠定了基础。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达非洲猪瘟病毒B602L
‑
B646L蛋白的重组腺病毒载体，其特征在于，以pAD
‑
CMV
‑3×
FLAG腺病毒载体为基础，引入B602L
‑
B646L基因以构建重组腺病毒载体pAD
‑
CMV
‑
EGFP
‑
B602L
‑
B646L；所述B602L
‑
B646L基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。2.一种权利要求1所述的表达非洲猪瘟病毒B602L
‑
B646L蛋白的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成B602L
‑
B646L基因，并在B602L
‑
B646L基因的起始密码子前添加CACC四个碱基；(2)将步骤(1)得到的B602L
‑
B646L基因和pENTRE
‑
EGFP
‑
TOPO载体进行TOPO克隆，得到pENTR
‑
EGFP
‑
ASFV
‑
B602L
‑
B646L；(3)将步骤(2)得到的pENTR
‑
EGFP
‑
ASFV
‑
B602L
‑
B646L通过LR重组反应于腺病毒骨架载体pAD
‑
CMV<...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱鸿飞，贾红，鑫婷，郭晓宇，袁维峰，崔帅，王洋，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：